STs)基因序列，利用序列 分析软件Clustal X进行同源性比较，在同源性最高的区域设计PCR扩增用引物，并利用 Primer Premier 5. 0生物软件中的引物分析功能对所设计引物进行各项参数的具体分析， 最终确定本发明扩增用的引物组，并进一步以其为核心制备检测试剂盒。而且，为了防止假 阴性，选用基因表达水平受环境因素影响较小的β-actin基因作为内参。β-actin基因 在个体各个生长阶段的大多数几乎全部组织中持续表达或变化很小，这种管家基因的表达 只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。所以，选择 β-actin的基因作为荧光定量PCR的内参。
[0064] 所设计的引物的序列信息如下：
[0065] GSTs 正向引物 LI :ccgttaggacgtcatgtaacgtc (SEQ ID NO: 1)、
[0066] GSTs 反向引物 L2ccaggtgagtgtgccttca(SEQ ID NO:2)、
[0067] 设计的内参的序列信息如下：
[0068] LGl:gagaggtatcctgactctg(SEQ ID NO:3)、
[0069] LG2 ：gacttagcactgtgtgtacc(SEQ ID N0:4)〇
[0070] 3)荧光定量PCR检测引物的效果
[0071] 利用 SYBR Green PCR Master Mix (Tiangen)试剂盒，在 ABI 7500System 上进行 荧光定量PCR。
[0072] 反应体系为：
[0073]
[0074] 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
[0075] PCR反应条件
[0076] 将配制好的β -actin内参和待测样品的PCR反应溶液置于PCR仪上进行扩增反 应。每个样品放3个孔，目的基因和内参基因同时扩增。采用两步法进行荧光定量PCR :95°C 预变性1〇!1^11;95°0 3()8、6()°0 3()8,4()个循环。反应结束后进行溶解曲线分析，从而检验退 火温度是否适宜，产物中是否含有引物二聚体。得到扩增曲线。结果表明扩增曲线的整体 平行性较好，曲线拐点清楚，基线平而无上扬现象。各管的扩增曲线平行性较好，表明扩增 效率相近，可以用来进行荧光定量PCR，分析基因的表达水平。
[0077] 扩增溶解曲线反映出实时荧光定量PCR的扩增特异性，如果每条溶解曲线只有一 个峰，表明扩增的特异性较好，如果有两个或者多个峰，则表明荧光定量PCR过程中存在非 特异扩增。扩增结果表明基因的溶解曲线的只有一个峰，这表明基因的特异性扩增效果较 好，可以用来进行荧光定量PCR，分析基因的表达水平。
[0078] 对引物的灵敏度进行了检测，具体步骤如下：
[0079] 1)将制备好的 cDNA 分别稀释成 IOOng/ μ L、50ng/ μ 1 和 IOng/ μ L。
[0080] 2)构建50 μ L PCR反应体系，分别以100ng、50ng和IOng为模板进行反应，电泳检 测。
[0081] 3)电泳结果发现：cDNA模板浓度为100ng、50ng和IOng的电泳扩增条带清晰，且 电泳图下方没有二聚体出现，说明该实验设计的引物灵敏度和特异性都很好，能够很好的 满足实验要求。
[0082] 4)引物的优化
[0083] 为了提高检测的灵敏度，将GSTs正向引物Ll的个别碱基进行修改优化后，得到了 新的引物序列ctagagcatgctagactgcag(SEQ ID NO:5);按照上述的特异性和灵敏性检测步 骤进行对比分析，结果发现：相比于未优化前的引物扩增IOngcDNA模板，扩增条带更清晰 明显。而且，在同样条件下，优化前的引物并不能从浓度7ng的cDNA样品中扩增出产物，而 优化后的产物能扩增出最低浓度为7ng的cDNA样品，且没有引物二聚体的出现，说明优化 后的引物能够显著提高灵敏度，且特异性没有收到任何影响。
[0084] 实施例2对孔雀石绿的检测
[0085] 孔雀石绿具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，在动物体内能长期 残留，通过代谢进入人和动物的机体后，可以通过生物转化，还原代谢成为脂溶性的无色孔 雀石绿，严重危害人类健康。许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。1992年，加 拿大就禁止其作为渔场杀菌剂。美国规定在食用水产品中禁止检出孔雀石绿和无色孔雀石 绿。2002年6月，欧盟颁布法令禁止在渔场中使用孔雀石绿。英国食品标准局认为孔雀石 绿是一种对人体有极大副作用的化学制剂，任何鱼类都不允许含有此类物质，并且这种化 学物质不应该出现在任何食品中。2002年5月，我国农业部已将孔雀石绿列入《食品动物 禁用的兽药及其化合物清单》，孔雀石绿在水生食品动物中被禁止使用。
[0086] 将贻贝暴露于5、10、20、30和40 μ g/L不同浓度的孔雀石绿中，其在72h内GSTs 相对表达量增长较快，而在72h之后表达量增长缓慢，相对平稳，可能与孔雀石绿已经降解 有关。
[0087] 本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与液相色谱质谱检测孔雀石绿含量的结 果比较。
[0088] 在5 μ g/L孔雀石绿浓度下，其GSTs基因表达已有显著增高，随着孔雀石绿浓度 增高，GSTs表达量也随之增高，而在5 μ g/L这个浓度下，采用液相色谱-质谱的检测方法 (《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定》）结果显示，在同样条件下， 贻贝中并未检测到孔雀石绿的存在，原因是孔雀石绿残留在体内的含量不足以检出（孔雀 石绿的液相色谱-质谱检测限为〇. 1 μ g/L)。在20 μ g/L孔雀石绿浓度下，贻贝肉中孔雀石 绿的含量检测结果仅为3. 5ppb，而GSTs基因的表达显著提高，增量接近1. 7倍（如图1)。 由此看见，针对水产品中的孔雀石绿来讲，本发明方法的灵敏度要高于化学检测方法。
[0089] 实施例3 :暴露于溴氰菊酯中的检测
[0090] 以溴氰菊酯为代表的拟除虫菊酯类农药对鱼高毒，因此在我国有相关的规定，菊 酯类农药禁止在水田中使用，但菊酯类农药的使用，通过环境的转移，水环境不可避免地受 到农药的影响和危害，对水产品造成污染。
[0091] 将贻贝暴露于1、2、4、6和8mg/L不同浓度的溴氰菊酯中，其在72h内GSTs相对表 达量急剧增多，而在72h之后表达量增长缓慢，相对平稳，可能在溴氰菊酯的诱导下该酶和 底物的结合开始趋于饱和。
[0092] 本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与气相色谱质谱检测溴氰菊酯含量的结 果比较。
[0093] 在lmg/L溴氰菊酯浓度下，其GSTs基因表达已有显著增高，随着溴氰菊酯浓度 增高，GSTs表达量也随之增高，在8mg/L时其相对表达量已高达1. 8倍之多（如图2);而 在lmg/L这个浓度下，采用《SFB/T 0120-2006食品中251种农药残留测定方法气相色谱 法-质谱检测法》结果显示，在同样条件下，贻贝中并未检测到溴氰菊酯的存在，原因是溴氰 菊酯残留在体内的含量不足以检出（溴氰菊酯的气相色谱-质谱检测限为10 μ g/L)。在 4mg/L溴氰菊酯浓度下，贻贝肉中溴氰菊酯的检测含量仅为35. 9 μ g/L，而GSTs基因的表达 显著提高，增量约为1. 6倍。由此看见，针对水产品中的溴氰菊酯来讲，本发明方法的灵敏 度要高于化学检测方法。
[0094] 实施例4对多氯联苯的检测
[0095] 多氯联苯是首批列入"关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约"（简称《斯德哥 尔摩公约》或《POPs公约》）受控名单的12种持久性有机污染物（POPs)之一。自上世纪70 年代起世界各国规定禁止生产和使用PCBs，但它与常规污染物不同，其化学性质很稳定，在 自然界中难于降解，多存在于土壤、河流底泥中，其持久性的存在长期对水产品造成污染， 对人类的主要危害是会引起癌变或畸变。
[0096] 将贻贝暴露于0. 1、〇. 5、1和2yg/L不同浓度的多氯联苯中，其在120h之内一直 呈现上升趋势，说明PCBs -直在诱导GSTs表达，其在体内蓄积并难以代谢，导致其GSTs酶 一直处于超表达状态。
[0097] 本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与气相色谱质谱检测多氯联苯含量的结 果比较。
[0098] 在0. 1 μ g/L多氯联苯浓度下，其GSTs基因表达已有显著提高至1. 3倍，随着多氯 联苯浓度增高，GSTs表达量也随之增高，在2 μ g/L时其相对表达量已高达2. 2倍之多（如 图3);而在0. 1 μ g/L这个浓度下，采用《GB/T 5009. 190-2006食品中指示性多氯联苯含量 的测定》结果显示，以PCB180为例，在同样条件下，贻贝肉中PCB180也有检出，但浓度很低 (多氯联苯的气相色谱-质谱检测限为〇. 05 μ g/L);在1 μ g/L的PCBs浓度下，贻贝肉中 PCB180的检测含量仅为0. 67 μ g/L，而GSTs基因的表达显著提高，增量为1. 8倍。
[0099] 由此可见，贻贝的GSTs对PCBs的诱导反应很敏感，GSTs非常适合作为一种生物 标志物来监测环境中PCBs存在情况，本发明方法的灵敏度要高于化学检测方法。
[0100] 在送检蛤蜊样品中，实验室按照SFB/T 0120-2006方法检测，检出蛤蜊肉中溴氰 菊酯含量为29. 7ppb ;采用GSTs基因转录表达差异的方法，发现其GSTs基因的表达量是阴 性样品GSTs基因的1. 7倍，差异显著，判断为受污染样品。本方法应用于实验室的实际检 测完全可行，且灵敏度更高，不会受到基质的干扰。
【主权项】
1. 一种用于检测贻贝谷胱甘肽硫转移酶的引物，其特征在于，所述的引物的上游引物 和下游引物的序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2。2. 如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的上游引物的序列为SEQ ID N0:5。3. -种用于作为贻贝基因表达的内参引物，其特征在于，所述的引物的上游引物和下 游引物的序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。4. 一种检测养殖水体中污染物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤： 1) 从贻贝肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA ; 2) 用引物对步骤1)反转录合成cDNA进行荧光定量PCR检测，所述的引物为权利要求 1所述的上游引物和下游引物，权利要求3所述的内参引物； 3) 以通过谷胱甘肽硫转移酶基因表达量的变化进行对比分析。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的引物为权利要求1所述的下游引物、 权利要求2所述的上游引物和权利要求3所述的内参引物。6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的污染物为农兽药、PAH、PCB、毒素、重 金属或环境内分泌物。7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的污染物为孔雀石绿、溴氰菊酯或多氯 联苯。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种应用贻贝检测养殖水体中污染物的方法，即采用贻贝体内谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)的含量变化来检测养殖水体中污染物的方法。本发明的方法相比目前的仪器化学方法，其检出限更低，方法更加灵敏。且验证实验室一致认为该方法准确、灵敏、操作简单、重复性好；不使用有毒的有机溶剂和标准品，对操作人员的安全更有保障，同时减少了对环境的污染；缩短了检测时间，降低了检测成本，有效地提升了实验室的检测能力。通过该项目的深入研究，可建立与国际接轨的食品安全生物检测体系。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104975107
【申请号】CN201510470382
【发明人】张晓梅, 静平, 刘靖靖, 王凤美, 王妍婷
【申请人】张晓梅
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年8月4日