r>[0021] 实施例1 : 1-2化合物（Raa为Gly时）的制备
[0022] (1)树脂活化：称取 500mg Rink Amide-AM resin，DCM 洗 4 次，加入 5ml DCM 溶涨 活化3h，DMF洗4次，加入20 %哌啶DMF溶液切割20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次， Kaiser' s试剂检测。
[0023] (2)接 Gly :DMF 洗 3 次，加入 360mg Fmoc-Gly-OH (4 倍量），455mg HBTU (4 倍量）， 162mg HOBt (4 倍量），142ul DIEA (4 倍量），溶于 5mlDMF，室温搅拌 2h，5ml DMF 洗 4 次，加 入20%哌啶DMF溶液切割20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser' s试剂检测。
[0024] (3)接 Trp (Boc) :DMF 洗 3 次，加入 630mg Fmoc-Trp (Boc)-〇H(4 倍量），455mg HBTU (4 倍量），162mg HOBt (4 倍量），142ul DIEA (4 倍量），溶于 5mlDMF，室温搅拌 2h，5ml DMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser' s 试剂检测。
[0025] (4)接 Gly :DMF 洗 3 次，加入 370mg Fmoc-Gly-OH (4 倍量），455mg HBTU (4 倍量）， 162mg HOBt (4 倍量），142ul DIEA (4 倍量），溶于 5mlDMF，室温搅拌 2h，5ml DMF 洗 4 次，加 入20%哌啶DMF溶液切割20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser' s试剂检测。
[0026] (5)接肉桂酸：DMF洗3次，加入178mg肉桂酸（4倍量），455mg HBTU(4倍量）， 162mg HOBt (4 倍量），142ul DIEA (4 倍量），溶于 5mlDMF，室温搅拌 2h，5ml DMF 洗 4 次，加 入20%哌啶DMF溶液切割20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser' s试剂检测。
[0027] (7)切割、解侧链保护基：产物加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml苯甲硫醚， 9. OmlTFA，室温搅拌2. 5h，溶液由黄色变为红色，过滤，N2吹去TFA，加入30ml冷的无水乙 酉迷，5000N/min离心5min，得白色沉淀，30ml冷的无水乙醚如此洗3次，真空干燥，质谱检测。
[0028] (8)粗肽用半制备HPLC分离纯化。收集的溶液脱去乙腈后，冻干制得纯肽。色谱 柱为C18半制备柱。
[0029] 其它目标化合物均按照上述方法制备得到。
[0030] 式A所示化合物的结构、高分辨质谱和纯度数据列于表1中：
[0031] 表1式A所示化合物的结构、高分辨质谱和纯度数据
[0034] 实施例2 :式A目标化合物对蚜虫的生物活性
[0035] 式A目标化合物对蚜虫的杀虫活性测定采用leaf-dipping法。将目标化合物配 成2000mg/L的测定液。再用l-5ml移液枪取Iml丙酮加入称量瓶，加入9ml含有0. 1 %曲 拉通X-100的水溶液，充分混勾，得200mg/L的测定液，然后再用含有0. 1 %曲拉通X-100的 水溶液逐级稀释，充分混匀得到所需浓度。将室内培育未接触过任何药剂的大豆蚜虫和大 豆叶片，用直径15mm的打孔器打出适合大小的叶片，分别浸入稀释好的药液中15秒，取出 晾干。然后将叶片放入生测板中，底部加入I %的琼脂保湿，每孔接入大豆蚜20 ± 3头，每个 重复3次。48小时后检查结果。死亡判断标准为：轻触虫体，不能正常爬行个体视为死亡。 计算校正死亡率，公式如下所示：
[0036] 校正死亡率（％) =(样品死亡率-空白对照死亡率να-空白对照死亡 率）*100% ·
[0037] 杀蚜活性LC50值用统计分析软件SAS计算得到。
[0038] 杀蚜活性测试结果见表2 :
[0039] 表2式A目标化合物对豆蚜的杀虫活性
[0040]
[0041] 拉：在20〇11^/1浓度测试下死亡率低于70%时，不再测试1^：5。值。
[0042] 实施例3 :式A目标化合物对植物病原菌的生物活性
[0043] 采用浑浊度-酶联板法测定了化合物对植物病原菌的室内离体抑制活性。
[0044] 供试祀标菌为7种常见的病原菌，包括辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici)、 水稻恶苗病菌（Fusarium fujikuroi)、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis)、辣椒炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides)、番前灰霉病菌（Botrytis cinerea)、番前早疫病菌 (Alternaria solani)和玉米丝黑糖病菌（Sporisorium reilianum) 〇
[0045] 将供试化合物用DMSO配制成104mg/L的母液，然后用无菌水稀释成系列梯度浓度 药液，置于4°C下备用。
[0046] 靶标菌的培养：将容易产孢菌株（水稻恶苗病菌、辣椒早疫病菌、玉米小斑病菌） 接种于最适培养基平板后进行产孢培养，待其产生大量分生孢子后，用无菌水将其孢子洗 涤下来，离心富集后，用PDB液体培养液负载孢子，配制成2 X IO5浓度的孢子悬浮液，置于 4°C下备用。将不易产生分生孢子的菌株接种在PDB液体培养基内摇培48h-72h，过滤后收 集新鲜的菌丝，然后称取0. 2g菌丝体，放入50mL的PDB液体培养基后，用组织捣碎机把菌 丝体捣碎成小菌丝段，制成菌丝段悬浮液，置于4°C下备用。
[0047] 将孢子悬浮液（菌丝段悬浮液）和提前配制的系列梯度药液按100 μ L+100 μ L的 量依次加入到每个微孔内，然后将96孔微孔板置于25°C的培养箱内静置培养，3-4d后用酶 标仪检测各处理的OD 595值。计算药剂对靶标菌的室内毒力。
[0048]
[0049]用统计分析软件对药剂浓度对数值与抑制率几率值进行回归分析，计算各药剂的 EC5。值及其95%置信限，并进行各药剂处理间的差异显著性分析。
[0050] 离体抑菌活性测试结果见表3 :
[0051 ] 表3式A目标化合物对供试的7种植物病原菌的离体抑制活性
[0054] 结果表明，本发明的化合物对蚜虫均具有杀死活性，其中化合物1-2的杀蚜活性 表现最突出，其LC5。值低于其他化合物及商品化药剂吡蚜酮，化合物1-3、1-5、1-6、1-9、 1-10的LC5。值也均低于商品化药剂吡蚜酮，具有作为蚜虫控制剂进行进一步应用开发的价 值；同时本发明的化合物对所测试的7种植物病原菌具有良好的离体抑制活性，特别是对 玉米丝黑穗病菌，在l〇mg/L浓度下，所有的化合物对其抑制活性均在50%以上，这是首次 发现昆虫激肽类似物的离体抑菌活性，具有作为农用杀菌剂进行进一步应用开发的价值。
【主权项】
1. 一类昆虫激肽类似物，其特征在于，所述类似物的结构通式为式A :其中，Raa为H、天然氨基酸或非天然氨基酸。2. 如权利要求1所述的昆虫激肽类似物，其特征在于，式A中，Raa为Gly、β-Ala、 γ -氨基丁酸、Pro、Hyp、Inp、1-氨基环己甲酸、邻氨基苯甲酸、2-氨基环己甲酸、间氨基苯 甲酸、Asp、Asn、N-Me-Ala 或 N-Me-Val。3. 如权利要求2所述的昆虫激肽类似物，其特征在于，式A中，Raa为Gly、β-Ala、 丫 _氨基丁酸、Pro、Hyp、Inp、邻氨基苯甲酸、2-氨基环己甲酸、Asn、N_Me_Ala或N-Me-Val 04. 如权利要求3所述的昆虫激肽类似物，其特征在于，式A中，Raa为Gly、β-Ala、Pro、 Hyp、邻氨基苯甲酸或2-氨基环己甲酸。5. 如权利要求1-4任一所述的昆虫激肽类似物，其特征在于，采用多肽固相合成法制 备。6. 如权利要求1-4任一所述的昆虫激肽类似物在害虫防治中的应用，其特征在于，所 述害虫为Φ牙虫。7. 如权利要求1-4任一所述的昆虫激肽类似物在植物病原菌防治中的应用，其特征在 于，所述植物病原菌为：辣椒疫霉病菌、水稻恶苗病菌、玉米小斑病菌、辣椒炭疽病菌、番茄 灰霉病菌、番茄早疫病菌或玉米丝黑穗病菌。8. 如权利要求7所述的昆虫激肽类似物在植物病原菌防治中的应用，其特征在于，所 述植物病原菌为玉米丝黑穗病菌。9. 一种药物，包含权利要求1-4任一所述的昆虫激肽类似物活性成分。
【专利摘要】本发明公开了一类昆虫激肽类似物及其在害虫控制、植物病原菌防治中的应用。本发明制备的化合物结构通式如式A所示，其中，Raa为H、(非)天然氨基酸，包括Gly、β-Ala、γ-氨基丁酸(GABA)、Pro、Hyp、Inp、1-氨基环己甲酸、邻氨基苯甲酸、2-氨基环己甲酸、间氨基苯甲酸、Asp、Asn、N-Me-Ala、N-Me-Val等。本发明运用模拟肽学修饰的方法，得到了一类新型的昆虫激肽类似物(式A)，所述类似物采用固相多肽合成方法制备。研究表明，式A目标化合物具有优异的杀虫活性，尤其对蚜虫具有良好防效，同时对供试的7种植物病原菌也有较好的离体抑菌活性，具有进一步开发应用的价值。
【IPC分类】A01N37/46, A01P3/00, A01P7/04, A01N43/38, C07K1/04, C07K5/107
【公开号】CN105061556
【申请号】CN201510415955
【发明人】杨新玲, 张传亮, 凌云, 宋敦伦, 刘西莉, 汪梅子, 吴小庆, 张喆
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月15日