同时提取分离广金钱草中三种黄酮碳苷化合物单体的方法和系统的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物化学技术领域，涉及一种植物中多种单体化合物的同时提取分离的方法和系统，具体的，本发明涉及从广金钱草中提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法和系统。
【背景技术】
[0002]广金钱草为豆科山蚂幢属植物Desmodium styracifol ium (Osbeck) Merr.，其药用部位为干燥地上部分，主要化学成分为黄酮、皂苷、多糖、生物碱等化合物。具有清热除湿，利尿通淋之功效。用于热淋、沙淋、石淋、小便涩痛、水肿尿少、黄疸尿赤、尿路结石。
[0003]夏佛塔苷(Schaftoside)也称为6_C_葡萄糖-8_C_阿拉伯糖洋序素，为黄色结晶性粉末；分子式:C26H28O14;分子量:564 ;图1显不其化学结构式。作为广金钱草及其相关药品质量控制用的夏佛塔苷(Schaftoside)对照品，系供中国药典2010版一部广金钱草项下鉴别和含量测定用，含量以92.5%计，而且本品有引湿性，打开包装后需要一次使用完毕。因此由于夏佛塔苷为药典标准检测所需对照品，市场需求量较大。因此，现有提取分离夏佛塔苷的方法、以及提高夏佛塔苷的含量和纯度的纯化技术和系统亟待改进。
[0004]木犀草素-6-C- β -D-吡喃葡萄糖-8-C- β -吡喃木糖苷，其结构式如图2所示，为黄色粉末；分子式:C26H28O15;分子量:580。该化合物存在于广金钱草药材中，作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品，以及广金钱草及其相关药物制剂如广金钱草总黄酮胶囊的质量控制用。现有提取分离图2所示化合物的方法和系统亟待改进。
[0005]Vicenin-2也叫6，8_ 二 -C-葡萄糖基芹菜素，为黄色粉末；分子式=C27H3qO15;分子量:594 ;图3显示其化学结构式。Vicenin-2存在于广金钱草药材中，作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品，以及广金钱草及其相关药物制剂如广金钱草总黄酮胶囊的质量控制用。现有提取分离Vicenin-2的方法和系统亟待改进。
【发明内容】
[0006]本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中的技术问题至少之一或者提出一种商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种从广金钱草中同时提取分离多种黄酮碳苷类化合物单体的方法和系统，利用该提取分离方法和系统得到的夏佛塔苷、木犀草素-6-C- β -D-吡喃葡萄糖-8-C- β -吡喃木糖苷和Vicenin-2，含量高、纯度高，有利于作为广金钱草及其相关药品的质量控制。
[0007]依据本发明的一方面，本发明提供一种从广金钱草中同时提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法，该方法包括以下步骤:利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其中包括，利用第一醇体系对所述提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，按照检测峰的出现顺序依次获得第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，所述第二分离部分-1包括所述夏佛塔苷，所述第二分离部分-2包括所述木犀草素-6-C- β -D-吡喃葡萄糖-8-C- β -吡喃木糖苷，所述第二分离部分-3包括所述Vicenin-20
[0008]本发明的该方法，利用多级色谱分离，包括组合利用大孔树脂纯化技术和中压制备，采用醇-水体系，从广金钱草提取物中同时分离提取广金钱草中的三种黄酮碳苷类化合物单体，工艺操作简单、生产时间短，产品收率高、纯度高，能够获得HPLC纯度达到98%以上的夏佛塔苷和Vicenin-2，以及纯度达93%的木犀草素-6_C_i3 -D-吡喃葡萄糖-8-C- β -吡喃木糖苷，获得的夏佛塔苷、木犀草素-6-C- β -D-吡喃葡萄糖-8-C- β -吡喃木糖苷和Vicenin-2都可作为广金钱草鉴别和含量测定用的化学对照品。该工艺步骤以及各个步骤的参数条件，是发明人综合考虑、多次调整试验大孔树脂色谱和反相中压色谱的组合及其各自的洗脱条件对广金钱草中的三种目标化合物的分离纯化效果的影响而确定下来的，该提取纯化过程不涉及毒性相对强的有机溶剂，提取分离操作过程及提取物都安全可靠。
[0009]图4显示本发明的一个实施例中的同时提取分离广金钱草中的图1-3所示化合物的方法的步骤流程图。根据本发明的实施例，上述本发明一方面的同时提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法，还可以具有以下技术特征至少之一:
[0010]根据本发明的一个实施例，如图5所示，所述利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，还包括:利用第三醇体系对所述第二分离部分-2和所述第二分离部分-3分别进行第三色谱分离，以对应获得第三分离部分-2和第三分离部分_3，所述第三分离部分-2包括所述木犀草素-6-C- β -D-吡喃葡萄糖-8-C- β -吡喃木糖苷，所述第三分离部分-3包括所述Vicenin-2 ;以进一步提高获得的产物中的木犀草素-6-Οβ -D-吡喃葡萄糖-8-C- β -吡喃木糖苷或Vicenin-2的纯度。在本发明的一个实施例中，所述第三醇体系为纯甲醇，所述第三色谱为凝胶色谱，较佳的为葡聚糖凝胶色谱S^hadex G-50，能够明显提高获得的木犀草素_6-C-13 -D-吡喃葡萄糖-8-C-13 -吡喃木糖苷和Vicenin-2的纯度，其中如者的纯度可提尚至93%以上，后者的纯度可提尚至98%以上。
[0011]根据本发明的一个实施例，所述利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物，包括:利用浓度50-95%的乙醇对所述广金钱草进行两次回流提取，合并两次回流提取所得的提取液，获得合并提取液，除去所述合并提取液中的乙醇，和/或除去所述合并提取液中的乙醇和离子，以及任选的，进行干燥，以获得所述提取物。两次浓度为50-95%乙醇回流提取获得提取物，是发明人经过多次试验摸索确定的，既能充分利用原料也能节省时间，利于规模化生产制备；去除提取液中的乙醇和/或离子，利于排除它们对后续分离纯化的干扰。
[0012]根据本发明的一个实施例，所述两次回流提取，其中一次的乙醇和广金钱草的重量比为12:1，回流提取的时间为1.5h-3h，任选的为2h，另一次的乙醇和广金钱草的重量比为10:1，回流提取的时间为lh-2h，任选的为1.5h。回流时，浓度为50-95%乙醇和广金钱草的比例以及回流时间，是发明人经过多次试验检测确定的，能够使原料得到高效提取。
[0013]根据本发明的一些实施例，所述第一醇体系为乙醇-水体系，该乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30-35 %，较佳的，所述乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30 %，所述第一色谱为大孔树脂。该乙醇-水洗脱体系中乙醇的浓度是发明人结合后续色谱分离条件、多次试验检测洗脱下来的峰中的目标单体的比例，经过多次调整优化确定的。在本发明的一个实施例中，所选用的为AB-8大孔树脂，三种目标化合物单体都主要存在于利用乙醇-水混合溶剂30/70?35/65梯度洗脱下来的分离部分中，其中以利用乙醇-水混合溶剂30/70梯度洗脱下来的分离部分中的三种目标化合物单体的总含量最高。
[0014]根据本发明的一些实施例，所述第二醇体系为乙醇-水体系，该乙醇-水体系中的乙醇的浓度为8-30%，较佳的，为10-30%。所述第二色谱为反向色谱，较佳的，选择的反向色谱为反向中压色谱，更佳的，选择C18柱，其柱压为l_20bar，优选的柱压为l_10bar。该反向色谱的类型、柱压以及乙醇-水洗脱体系中的乙醇浓度是发明人结合其对第一分离部分中三种目标成分各自的比例的影响，多次试验优化确定的，利于在简单操作和短时间内，同时收率高、纯度高的获得三种目标化合物单体。
[0015]根据本发明的一个实施例，所述利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，包括:利用乙醇浓度为a的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱25-40min，接着换用乙醇浓度为[a，b]的乙醇_水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱180-250min，按检测峰的出现顺序分别收集，以依次获得所述第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，其中，a的取值范围为8-18%，b的取值范围为20-30%。先利用一个浓度的乙醇-水体系等度洗脱，再进行梯度洗脱，能够提高分离提取效率；等度洗脱和梯度洗脱的乙醇浓度或浓度范围，以及洗脱时间，是发明人考虑收率、时间、回收的分离部分的复杂度、分离部分中三种目标成分各自的比例等，多次试验确定下来的。
[0016]根据本发明的另一个实施例，如图6所示，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，包括:利用乙醇浓度为c的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱30min，接着换用乙醇浓度为[c，d]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱200min，按检测峰的出现顺序分别收集，以依次获得初级第二分离部分-1、初级第二分离部分-2和初级第二分离部分-3 ;利用乙醇浓度为e的乙醇-水体系分别对所述初级第二分离部分-1、初级第二分离部分-2和初级第二分离部分-3进行等度洗脱30min，接着分别换用乙醇浓度为[e，f]的乙醇-水体系进行梯度洗脱200min，按检测峰的出现顺序分别收集，以对应获得所述第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，其中，c和e的取值范围为8-18%，d和f的取值范围为20-30%，e>c，d ^ f ο前后两次，都先利用一个浓度的乙醇_水体系等度洗脱，再进行梯度洗脱，能够提高分离提取三种化合物单体的效率；前后两次的等度洗脱和梯度洗脱的乙醇浓度或浓度范围以及各自的洗脱时间，是发明人