使用外周注射aav载体向运动神经元进行广泛基因投送的制作方法
【专利说明】使用外周注射AAV载体向运动神经元进行广泛基因投送
[0001]本申请是国际申请日2008年10月3日、国际申请号PCT/EP2008/063297于2010年5月24日进入中国国家阶段、申请号200880117413.0、发明名称“使用外周注射AAV载体向运动神经元进行广泛基因投送”的申请的分案申请。
技术领域
[0002]本发明涉及将基因投送到哺乳动物中枢神经系统细胞的组合物和方法。本发明还涉及通过治疗性基因的表达，在哺乳动物中治疗运动神经元病症的方法。本发明基于未预料到的发现，即AAV载体的外周注射导致绕过血脑屏障，并大量感染运动神经元以及中枢神经系统中的其他细胞。本发明可用于任何哺乳动物，包括人类对象。
【背景技术】
[0003]运动神经元(MN)疾病，例如脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或肯尼迪(Kennedy’ s)病，是神经变性病症，其特征在于脊髓、脑干和/或皮层运动中MNs的选择性变性(Monari 2005 ;Pasinelli 和 Brown 2006) ; (MacLean, Warne 等，1996)。这些疾病没有治疗方法，主要是因为经全身注射进行药物投送，受到存在“血脑屏障”(BBB)的阻碍。这种解剖学和生理学屏障由中枢神经系统(CNS)毛细血管内皮细胞之间的紧密联结形成，防止分子在循环与CNS之间的便捷分子通道(Scherrmann 2002)。MN的另一种供应方法，将重组蛋白直接注射到CNS实质中，也是困难的，这是由于外科程序的侵入性妨碍了潜在的临床应用。
[0004]经典药物学的失败，导致科学界开发了具体来说基于使用病毒载体的基因转移技术的新治疗策略。但是，常规的病毒载体一般不能透过BBB，第一种提出的基因转移策略包括将载体鞘内投送或直接注射到脊髓实质中(Davidson, PNAS 2000) (Azzouz, Hottinger等，2000)。但是，这些侵入性方法不能产生有效的广泛CNS转导。也使用了将病毒载体注射到脑室中，目的在于转导脉络丛和室管膜的上皮细胞，介导脑脊液(CSF)中治疗性蛋白的分泌，并进一步扩散通过CNS实质(Passini和Wolfe 2001)。但是，重组蛋白向整个神经组织的扩散远远不够最好，并且同样，与外科程序相关的潜在风险也是这种方法临床应用的障碍。
[0005]通过肌肉内(1.m.)注射，利用病毒载体向丽的逆向轴突运输，进一步开发了替代的非侵入性策略。基因载体例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)或带有狂犬病G糖蛋白的马贫血病毒假型(EIAV)，的确在肌肉内注射后经历了沿着MN轴突的逆向运输，并在实验动物中成功地用于转导下位MN(Finiels等，1995 ；Kaspar等，2003 ；Azzouz等，2004)。然而，这种方法的临床价值仍然是成问题的，具体来说是由于在影响患者的大部分运动单位的病理中，为了定向MN，需要大量的注射位点和病毒粒子。
[0006]为了抵消这些困难，我们在小鼠中试验了新的AAV血清型和基因组在肌肉内a.m.)、静脉内α.ν.)和腹膜内α.ρ.)投送后的丽转导效率。具体来说，我们比较了血清型I和9的重组单链和自身互补型AAV载体(分别为ssAAV和scAAV)在小鼠中介导CNS转导的效率。
[0007]我们的主要结果证明，在1.v.投送到小鼠后，重组AAV载体(例如scAAV9)特别有效地转导脊髓MNs。此外，我们显示了这种方法在大动物模型中的可行性，该动物模型是类似于人类III型SMA、与LIXl基因的缺失相关的常染色体隐性SMA的家猫模型(Fyfe等，2006)。我们的方法也允许转导其他CNS细胞，包括神经胶质细胞，海马和缰核中的神经元，以及星形细胞。因此，本发明第一次显示了在小鼠中，有可能在单次1.V.注射后将目标基因转移到丽S，实现了向脊髓和/或其他神经细胞的广泛基因投送，因此提供了治疗丽疾病的新途径。
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[0009]本发明涉及使用重组AAV载体向CNS投送治疗性产物的新的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及通过AAV载体的外周给药，用于将基因投送到哺乳动物对象的运动神经元或神经胶质细胞中的组合物和方法。
[0010]更具体来说，本发明的目的涉及使用含有目标基因(例如编码治疗性或诊断性产物)的AAV载体，来制造通过所述AAV载体向所述对象进行外周给药而向中枢神经系统中的细胞、特别是运动神经元或神经胶质细胞投送基因的药物。
[0011]本发明的另一个目的涉及使用含有目标基因(例如编码治疗性或诊断性产物)的AAV载体，来制造通过所述AAV载体向所述对象的外周给药，从而向脊髓运动神经元投送基因的药物。
[0012]本发明的另一个目标在于在哺乳动物中向中枢神经系统中的细胞、特别是运动神经元或神经胶质细胞投送基因的方法，方法包括通过外周途径向哺乳动物给药含有所述基因的AV载体，所述给药使得中枢神经系统中的细胞、特别是运动神经元或神经胶质细胞被所述AAV载体感染，从而向中枢神经系统中的细胞、特别是运动神经元或神经胶质细胞投送所述基因。
[0013]本发明的目的还涉及使用含有治疗性基因的AAV载体，来制造在对象中治疗运动神经元病症的药物，其中所述AAV载体通过向所述对象外周注射来进行给药，所述给药引起(脊髓)运动神经元的感染和基因在(脊髓)运动神经元中的表达。
[0014]本发明的另一个目标涉及使用AAV载体，来制造通过所述载体的外周注射在对象的(脊髓)运动神经元中产生治疗性蛋白或RNA的药物。
[0015]本发明还涉及使用AAV载体，通过跨过血脑屏障，向中枢神经系统中的细胞、特别是运动神经元或神经胶质细胞投送基因。
[0016]本发明还涉及在哺乳动物对象中跨过血脑屏障的基因治疗方法，方法包括向对象外周给药AAV载体。
[0017]本发明的另一个目标是在哺乳动物对象中，对中枢神经系统中的细胞、特别是运动神经元进行遗传修饰的方法，方法包括向对象外周给药AAV载体。
[0018]本发明还涉及使用AAV载体，来制造通过AAV载体的外周给药向脊髓投送基因的药物。
[0019]本发明还涉及向对象的脊髓进行基因投送的方法，方法包括向对象外周给药含有所述基因的AAV载体。
【附图说明】
[0020]图1、在肌肉内注射AAV后向新生小鼠肌肉和CNS进行广泛基因投送(蓝色:mSEAP组织化学染色)。在注射SS-或scAAVl或AAV9后3天(PM)或7天(PN8)时(a)腓肠肌、(b)脑(第三脑室)和(c)脊髓的代表性横向切片。
[0021]N1:未注射；PM，出生后第4天；PN8，出生后第8天；ss，单链；sc:自身互补。比例尺(b, c) 100 μ mD
[0022]图2、在腹膜内注射AAV后向新生小鼠肌肉和CNS进行广泛基因投送(蓝色:mSEAP组织化学染色)。(a)横膈肌，(b)第三脑室(箭头:表达mSEAP的脉络丛细胞；箭头的头:室管膜细胞)和(c)CNS实质(箭头:神经元细胞)的代表性组织切片。
[0023]N1:未注射；PM，出生后第4天；PN8，出生后第8天；ss，单链；sc:自身互补。比例尺(a，b，c) 100 μ m ； (d) 40 μ m。
[0024]图3、腹膜内投送自身互补型AAV9-GFP在新生小鼠中介导了 CNS转导。投送AAV后7天，对代表性的脑和脊髓横向切片进行GFP免疫组织化学处理。在(a)脉络丛上皮细胞，(b)具有神经元(箭头的头和上方框)和神经胶质细胞(箭头和下方框)形态的海马细胞，(C)内嗅皮层细胞(箭头指示具有典型神经元形态的细胞)，(d，e)脊髓的细胞(箭头指示具有运动神经元形态的GFP标记的细胞)和(f)颈部脊髓中的感觉纤维中，检测到转基因的表达。比例尺40 μ m。
[0025]图4、自身互补型AAV9载体的肌肉内投送允许在新生小鼠中转导CNS细胞。注射AAV后7天，对脑和脊髓组织学切片进行GFP免疫组织化学处理。在(a)脉络丛上皮细胞(箭头)和室管膜上皮细胞(箭头的头)，(b，c)中隔的神经细胞和(d，e)内嗅皮层的神经细胞，以及(f)颈部脊髓中锥体交叉水平处的皮质脊髓束(箭头)中，检测到转基因的表达。比例尺20 μ m。
[0026]图5、静脉内投送自身互补型AAV9载体，在新生小鼠的CNS中介导了 GFP表达。在AAV注射后7天，GFP免疫染色处理的脑和脊髓组织学切片的代表性显微照片。在(a)脉络丛(箭头)和室管膜(箭头的头)的上皮细胞，(C)脑血管，(d，f)具有神经元(箭头)和神经胶质细胞(箭头的头)形态的海马细胞，(g)内嗅皮层的神经元样细胞中，检测到GFP阳性细胞。在整个脊髓中，在(h)颈部、(i)胸部和(j)腰部水平上，许多运动神经元样的细胞体(箭头)和纤维(箭头的头)被有效转导。在未注射的小鼠的CNS中没有观察到染色，如来自(b)第三脑室或(e)海马或(k-m)脊髓的代表性切片所显示。比例尺(a，b)100ym，(c, d, f) 40 μ m，(e, g) 100 μ m，(h_m) 20 μ m。
[0027]图6、表达GFP的单链AAV9载体在新生小鼠的CNS中介导转基因的表达。在1.V.注射SSkm后3周，GFP免疫组织化学处理的新生小鼠的脑和脊髓切片的代表性显微照片。(a)脉络丛(星号)，海马(箭头的头和框)和缰核(箭头)，(b)正中隆起和(c-e)腹侧脊髓中运动神经元样细胞中的GFP阳性细胞。比例尺组b:100 μ m ;c，d, e:20 μ m。
[0028]图7、重组AAV9载体介导转基因在成年小鼠CNS中的表达。在静脉内投送3xlOn (b)或 IxlO12 (c-h)个表达 mSEAP 的 scAAV9 (a, c)、ssAAV9 (b)、scAAV I (d)和 ssAAVl (e)的载体基因组后4周，来自成年C57bl6小鼠的代表性冠状脑切片；比例尺组g，h, j:100 μ m ;组 i, k, 1:20 μ m。
[0029]图8、静脉内注射的重组AAV9载体介导转基因在成年小鼠脊髓中的表达。在静脉内投送IxlO12个表达mSEAP的ssAAV9 (a, b)、scAAV9 (c, g)载体基因组后4周，来自成年C57bl6小鼠的代表性脊髓横向切片。
[0030]比例尺(a，b，e):40 μm，框:20 μm ; (c, d):100 μπι ； (f):50 μm ； (g):20 μmD
[0031]图9、在LIX-1猫中静脉内注射AAV9-GFP介导了转基因在整个脊髓中的表达。在将表达GFP的scAAV9注射到颈静脉中以后10天，使用激光扫描共聚焦显微术(图9a，c)或GFP免疫组织化学处理(图9b，d)，观察了来自2日龄LI