一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种蛋白质分析方法在筛选药物中的用途，特别涉及筛选治疗慢性脑 供血不足的一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法
【背景技术】：
[0002] 养血清脑颗粒是由天士力自主研发用于治疗血虚肝亢所致的慢性脑缺血不足的 中药新药。主要通过改善脑膜微循环，增加脑血流量，显著减轻脑缺血引起的神经缺损症 状，明显抑制神经细胞凋亡及突触结构改变，对慢性脑缺血的病理改变起到预防和治疗的 作用。缺血再灌注损伤引起神经元损伤作为引起慢性脑供血不足主要原因之一，其引起神 经细胞损伤的发病机制尚无定论。因此，研究养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足的作用机 制及预后祀标蛋白标志物迫在眉陡。
[0003] 中药制剂有效部位或有效成分进入机体发挥作用，必然会引起从遗传信息到整体 功能实现从分子、细胞、器官、整体多个层面的结构与功能状态的改变。调节这些层面的结 构与功能的本质是基因，而直接的作用者主要是蛋白质。在对养血清脑颗粒治疗慢性脑供 血不足作用机制研究中，现有对神经细胞凋亡相关基因与神经细胞凋亡相关因子等研究， 缺乏以蛋白质表达为指标进行相关药物治疗作用机制方面研究。
[0004] 本方法采用了与人类基因组同源性高（约87% )，基因组信号调控也相似的一种 脊椎动物斑马鱼作为模式动物（专有名词），利用比较蛋白质组相对定量分析的方法筛选 出给药前后的差异蛋白质组。尝试从分子结构水平上来揭示中药组方的复杂作用机制，为 后续进行蛋白组学生物质控方法开发提供物质基础。
[0005] 本发明提供一种用于筛选养血清脑颗粒在治疗慢性脑供血不足的关键差异蛋白 的分析方法。建立基于斑马鱼神经损伤的药效模型，以养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足 的神经元保护作用为生物活性指标，应用蛋白组学方法进行筛选斑马鱼神经元损伤的预后 标志物。
[0006] 本方法应用核素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术对四组斑马鱼模型蛋白分别进行标记，结合联合 纳升液相色谱和串耳关质谱（nano liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Nano-LC-MS/MS)分离、分析肽段，采用Proteinpilot 4. 2软件对蛋白进行鉴定和定量分 析，对获得的差异蛋白进行生物信息学分析，并使用同源性分析获取斑马鱼神经组织相关 蛋白质与人同源的蛋白质。
[0007] 本方法筛选出了 33个与神经元损伤相关的差异表达蛋白质，并为斑马鱼神经元 损伤的预后提供了可能的生物标志物。
【发明内容】
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[0008] 本发明提供一种应用核素标记相对和绝对定量技术对神经损伤进行蛋白标记，并 结合联合纳升液相色谱和串联质谱分离、分析肽段，采用Proteinpilot 4. 2软件对蛋白进 行鉴定和定量分析，从而筛选出养血清脑颗粒在治疗慢性脑供血不足方面的关键差异蛋白 的分析方法。
[0009] 为此，本发明提供一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法。
[0010] 本发明所述分析方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；
[0012] 步骤2，药物组用药物处理；
[0013] 步骤3，各组提取总蛋白；
[0014] 用蛋白质裂解液裂解，再进打酶解，使用iTRAQ试剂盒进打蛋白标记；用1?效液相 色谱仪高pH反相色谱分离总蛋白；
[0015] 步骤4,质谱上样分析
[0016] 采用质谱分析数据ProteinPilot? Software Beta软件对NCBInr数据库进行检 索鉴定蛋白；合并搜库，导出数据用rosT软件分析。
[0017] 同时用m/z对各组报告离子的峰面积积分进行相对定量分析；鉴定蛋白的组间比 值>1. 5或〈0. 5被认为存在表达差异。
[0018] 步骤5,生物信息学分析
[0019] 采用DAVID生物学功能注释分析，对差异表达蛋白质进行全面的生物学功能注 释，筛选出与斑马鱼神经元损伤相关蛋白；另外对差异表达蛋白进行基于G0分析的生物学 过程、细胞组分和分子功能方面的富集分析；
[0020] 使用NCBI的blast工具对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取 斑马鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质，以 evalue〈〇. 001作为卡值。以筛选出治疗 神经元损伤的预后蛋白标志物；
[0021] 使用MetaCore软件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功能相关 通路。
[0022] 其中，步骤1采用吗替麦考酚酯作为中枢系统神经毒性诱导剂，诱导建立斑马鱼 脑部和中枢神经损伤模型。并选择模型组、空白组、模型给药组和空白给药组四组对照。每 组选用30-150尾斑马鱼，
[0023] (1)本方法所用的斑马鱼为Albino品系，由杭州环特生物科技有限公司提供。在 加入诱导药物的同时加入养血清脑颗粒。
[0024] (2)实验分组为：
[0025] ⑴斑马鱼神经损伤模型组；
[0026] (2)养血清脑颗粒药物处理1000 μ g/ml组；
[0027] ⑶空白溶剂对照组；
[0028] ⑷空白模型药物处理500-1500 μ g/ml组。
[0029] (3)造模的判定：
[0030] 由于空白对照组斑马鱼脊神经细胞凋亡较少，凋亡细胞荧光信号弱；吗替麦考酚 酯诱导的模型组斑马鱼脊神经细胞凋亡非常明显（如图1所示）。可根据荧光信号的强弱 来判断模型是否成功。
[0031] 判定过程如下：
[0032] -药物处理结束后，对斑马鱼进行荧光染色；
[0033] -染色结束后，每组随机挑选10尾斑马鱼在显微镜下观察并拍照；
[0034] -利用图像处理软件进行图像分析，计算神经凋亡细胞染色强度（S)，进行定量 分析，统计学处理结果用Y：hSE表示，表1所示；
[0035] 表1凋亡细胞荧光强度（Mean土 SD)
[0036]
[0037] 其中，步骤2所述药物处理，方法如下：
[0038] 药物处理：
[0039] 除空白组外其余各组均用0. 25-0. 4μ Μ吗替麦考酚酯造神经损伤模型。选用AB 系Id的胚胎斑马鱼，用0. 25-0. 4μ Μ吗替麦考酚酯和药物同时处理12-24h，药物样品分别 用0. 1-0. 3 % DMS0溶解至所需浓度。
[0040] 优选处理方法：除空白组外其余各组均用0. 25 μ Μ吗替麦考酚酯造神经损伤模 型。选用ΑΒ系Id的胚胎斑马鱼，用0. 25 μ Μ吗替麦考酚酯和药物同时处理24h，药物样品 分别用〇. 1% DMS0溶解至所需浓度。
[0041] 其中，步骤3,各组提取总蛋白；方法如下：
[0042] 蛋白质提取
[0043] 分别对上述四组斑马鱼加入300-800 μ 1裂解液（含ImM PMSF-苯甲基磺酰氟化 物）于离心管中碾磨，置于冰上裂解10-20min，超声2-5min，再置于冰上裂解10-20min。
[0044] 裂解后，在0-4°〇下10,000-15,000印111离心51^11，取上清分装于离心管中并置 于-80。。。
[0045] 蛋白质的酶解
[0046] 用超滤方法将上述蛋白溶液替换成蛋白溶解液，并用bradford方法定量。每组分 别取30-80ug加入1 % SDS (十二烷基硫酸钠）luL充分混悬溶解样品；加入还原试剂2 μ L， 混匀，60°C反应1小时；加入半胱氨酸封闭试剂1 μ L，室温反应10分钟；按照酶：蛋白质= 1 :50的比例加入trypsin-胰蛋白酶，35-40°C酶解过夜。
[0047] iTRAQ化学标记
[0048] 使用iTRAQ试剂盒进打蛋白标记；3?白组用114标记，空白给药组用115标记，丰旲 型空白组用116标记，模型给药组用117标记。
[0049] 先于114、115、116、117各管标记试剂中加入70 μ L乙醇，混匀，分别加入各管样品 中，室温反应一小时，标记后混合四组标记好的样本；冻干备用。
[0050] 高效液相色谱仪高pH反相色谱分离
[0051] 将混合标记好的样品100 μ g用50 μ L流动相A进行溶解，并采用高效液相色谱仪 250X4. 6mmC18反相柱进行液相分离，提取总蛋白；每分钟一管组分收集，在6% -35%有效 梯度内，共30组分；将30个馏分，真空干燥备用。
[0052] 色谱条件
[0053] ⑴流动相：
[0054] A 相，2 % ACN-98 % H20 (氨水调 pH 10. 0);
[0055] B 相：98 % ACN-2 % H20 (氨水调 pH 10. 0)。
[0056] ⑵溶剂梯度：
[0057] 5%-8%B,lmin ；8%-32% B, 25min ；32%-95% B, 27min ；95%,31min ；95%-5% B，32min ;
[0058] (3)柱温：