哪几类生物学过程或分子功能上显著富集（P < 0. 1)，从而从整体上把握鉴定蛋白质与预 期功能分布之间的吻合度，还可以获得与某些特定功能相关的蛋白质分子。
[0119] 本发明使用 NCBI 的 blast 工具（http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi) 对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取斑马鱼神经组织相关蛋白质与人 同源的蛋白质。以eval Ue〈0. 001作为卡值。以筛选出养血治疗神经元损伤的预后蛋白标 志物。
[0120] 本发明使用MetaCore软件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功 能相关通路。有利于阐明筛选出的蛋白作为养血治疗神经元损伤的预后标志物的合理性。
[0121] 本发明的有益效果
[0122] 该方法利用了蛋白质组学中同位素标记的相对和绝对定量技术（iTRAQ)，相比于 传统蛋白质组学中所运用的定性及定量方法，具有精确度更好、可靠性更高、可操作性更强 的优势。经过反复实验研究发现，尤其适用于对低丰度蛋白质的研究，可同时支持4种或8 种样品，并能够通过同位素标记有效而准确地把握各差异蛋白的动态变化。
[0123] 利用本方法鉴定出了养血清脑颗粒在治疗慢性脑供血不足方面，与斑马鱼神经元 损伤相关的33个差异表达蛋白质，并且建立了一套iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术，有效筛 选出特异性、差异性靶标蛋白的可行方法。为斑马鱼神经元损伤的预后提供了可能的生物 标志物，更好的阐明了其治疗疾病的作用机制。具有模型可靠，可控可评，稳定性好等特点， 为后续蛋白组学生物质控的分析方法和全面控制中药质量的现代质量标准打下基础。具体 表现为：
[0124] (1)应用蛋白组学相对蛋白定量技术确定了与斑马鱼神经元损伤相关的33个差 异表达蛋白质，并建立了应用iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术筛选特异性差异蛋白方法。
[0125] (2)本方法中，每个实验组别选用100尾斑马鱼，可有效的避免个体差异带来的影 响，具有试验结果准确、稳定和可靠的特点。
[0126] (3)应用iTRAQ技术联合Nano LC-MS/MS技术进行差异蛋白的筛选，iTRAQ试剂对 总蛋白的覆盖率可达98%以上，具有精确度好、可靠性高、可操作性强的特点，可做到对低 丰度蛋白质的准确定量。
[0127] (4)应用生物信息学方法对33个与神经元相关的差异蛋白进行生物学功能注释 分析、与人同源性分析以及与神经组织功能相关通路分析，获得4组养血治疗神经元损伤 的预后标志物。
[0128] (5)本方法以整体模式动物斑马鱼构建神经元损伤药效模型，利用比较蛋白质组 学相对定量分析的方法筛选出给药前后的差异蛋白质组，并进行疾病预后标志物的筛选。 从分子层面揭示中药组方的复杂作用机制。
[0129] (6)本方法可以用于其它中药制剂复杂作用机制研究的参考。
[0130] 本发明中首次使用斑马鱼作为模式动物用于养血清脑颗粒治疗疾病作用机制研 究，需要进行保护，另外本实验筛选出的与斑马鱼神经元损伤相关的33个差异表达蛋白质 以及通过生物学功能注释分析、与人同源性分析以及与神经组织功能相关通路分析，获得4 组靶标蛋白养血治疗神经元损伤的预后标志物需要进行保护。
【附图说明】
[0131] 图1斑马鱼药效模型评价指标，图中反色荧光点为斑马鱼凋亡神经细胞
[0132] 图2差异表达蛋白质的生物学过程富集分布图a).生物学过程；b).细胞组分； c).分子功能。
【具体实施方式】
[0133] 以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0134] 仪器与试药
[0135] 超速低温离心机为Beckman公司产品；高效液相色谱仪：型号：RIG0L3220(北京 普源精电）；色谱柱：(：18反相柱仏8 61&，（：18色谱柱，250\4.61111111.(1.，填料颗粒直径： 5μπι);天津博纳艾杰尔；Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOF 5600质谱仪和串级质谱数 据分析使用ProteinPilot 4. 2软件均为ABI公司产品。
[0136] iTRAQ试剂盒：iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit (Applied Biosystems);蛋白浓度 检测试剂盒（Bradford公司）；Tris(BBI公司）；NaF(Fluka公司）；组织裂解液所用苯甲 脒（Benzamidine)和4-(2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF)购自Sigma公司；亮抑酶肽 (Leupeptin)和抑肽酶（Aprotinin)购自上海生物工程公司。丙酮、氨水均购自北京化工 厂；ACN、FA均购自sigma公司。
[0137] 本发明选择斑马鱼为Albino品系（由杭州环特生物科技有限公司提供）；用吗替 麦考酚酯诱导建立斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型；吗替麦考酚酯是一种用于器官移植的 免疫抑制剂，临床研究表明吗替麦考酚酯会诱发神经毒性。
[0138] 斑马鱼神经元损伤模型建立与蛋白抽提
[0139] 实验斑马鱼为Albino品系，由杭州环特生物科技有限公司提供；用吗替麦考酚酯 诱导建立斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型；在加入诱导药物的同时加入养血清脑颗粒。
[0140] 实验分组为：⑴斑马鱼神经损伤模型组；⑵药物处理1000 μ g/ml组；⑶溶剂对 照组；⑷正常药物处理1000 μ g/ml组，每组100尾斑马鱼，药物处理结束后，收集斑马鱼 于-80°C保存。
[0141] 分别对上述四组蛋白中分别加入300-800 μ 1裂解液（含ImM PMSF)于离心管中 碾磨，置于冰上裂解10_20min，超声2-5min，再置于冰上裂解10-20min。裂解后，在0-4°C 下10, 000-15, OOOrpm离心5min，取上清分装于离心管中并置于-80°C。
[0142] 蛋白质酶解
[0143] 对上述四组蛋白用超滤方法将蛋白溶液替换成蛋白溶解液，并用bradford方法 定量。每组分别取50ug加入1 % SDS (体积为luL)充分混悬溶解样品；加入还原试剂2 μ L， 混匀，60°C反应1小时；加入半胱氨酸封闭试剂1 μ L，室温反应10分钟；按照酶：蛋白质= 1 :50的比例加入胰蛋白酶，35-40°C酶解过夜；
[0144] iTRAQ化学标记
[0145] 空白组用114标记，空白给药组用115标记，模型空白组用116标记，模型给药组 用117标记；先于114、115、116、117各管标记试剂中计入70 μ L乙醇（试剂盒自带），混匀， 分别加入各管样品中，室温反应一小时，标记后混合四组标记好的样本；冻干备用。
[0146] 高效液相色谱仪高pH反相色谱分离
[0147] 采用高效液相色谱仪250X4. 6mmC18反相柱进行LC蛋白质分离；流动相中A :2% △^98%!120(氨水调口!110.0);流动相8:98%4^2%!120(氨水调口!110.0) ;溶剂梯度： 5%-8%B,lmin ；8%-32% B, 25min ；32%-95% B, 27min ；95%,31min ；95%-5% B, 32min ； 柱温：45°C ;流速：0· 7mL/min ;检测波长：214nm。组分收集：每分钟一管，在6% -35%有效 梯度内，共30组分；将30个馏分，真空干燥备用。
[0148] 质谱上样分析
[0149] 取上述样本，溶解于A液（1. 9 % ACN/98 % H20/0. 1 % FA)合并为10个组分， 12,000r 离心 3min，取上清采用 Eksigent 液相-AB SCIEX TripleTOF? 5600 质谱仪检测。
[0150] 色谱条件：液相：Eksigent Nano LC 2D plus ;富集柱：自制 C18, 5um，IDlOOum， 20mmLength ;分离柱：自制 C18, 3um，ID75um，120mmLength ;流动相：A :1· 9 % ACN-98 % H20-0. 1% FA ;B :98% ACN-1. 9% H20-0. 1% FA ;洗脱条件：5% -12% B，5min ;12% -22% B，21min ;22% -32% B，31. 5min ;32% -90%，36min ;90% -5% B，40min ;流速：330nl/min ;
[0151] 质谱条件：数据采集时间：40min，喷雾电压：2. 3KV ;毛细管温度：23. 92°C ;碰撞能 量：45eV ;采集质量范围：350-1250Da。
[0152] 质谱鉴定
[0153] 质谱分析数据用ProteinPilot? Software Beta对NCBInr数据库进行检索鉴定 蛋白，报告置信度在95%以上的蛋白质，同时用m/z 114、115、116、117报告离子的峰面积 积分进行相对定量分析，以m/z 116为对照，按114 : 116U15 : 116U17 : 116的比值， 选择p < 0. 05的结果进行报告；鉴定蛋白的组间比值>1. 5或〈0. 5被认为存在表达差异。
[0154] 通过4标iTRAQ结合2D-LC