-MS/MS分析，在4组样品中共同鉴定到蛋白质1993种， 报告置信度均在95%以上，以116为对照，114/116组差异表达蛋白质107个，117/116组差 异表达蛋白质33个。以差异表达倍数大于或等于1. 5倍（即Ratio〉= 1. 5或Ratio〈= 0.50)作为差异表达阈值。从114/116组差异表达蛋白中功能注释的结果中可知，33个蛋 白质与脑及中枢神经组织相关.
[0155] 生物信息学分析
[0156] 通过生物信息学方法，使用DAVID(http://david. abcc. ncifcrf. gov)对差异表 达蛋白质进行全面的生物学功能注释，获取与这批差异表达蛋白质所有相关的功能信息。 也对差异表达蛋白质进行了基于Gene Ontology (G0)的生物学过程，细胞组分和分子官能 团进行了富集分析；选择KEGG的通路数据库对蛋白所涉及的通路进行分类和富集分析。使 用NCBI的blast工具对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取斑马鱼神经 组织相关蛋白质与人同源的蛋白质。以E-value〈0. 001作为卡值。同时使用MetaCore软 件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功能相关通路。
【主权项】
1. 一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组； 步骤2,药物组用药物处理； 步骤3,各组提取总蛋白； 用蛋白质裂解液裂解，再进行酶解，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；用高效液相色谱 仪高pH反相色谱分离总蛋白； 步骤4,质谱上样分析 采用质谱分析数据ProteinPilot?SoftwareBeta软件对NCBInr数据库进行检索鉴 定蛋白；合并搜库，导出数据用TOST软件分析；同时用m/z对各组报告离子的峰面积积分 进行相对定量分析；鉴定蛋白的组间比值>1. 5或〈0. 5被认为存在表达差异。 步骤5,生物信息学分析 采用DAVID生物学功能注释分析，对差异表达蛋白质进行全面的生物学功能注释，筛 选出与斑马鱼神经元损伤相关蛋白；另外对差异表达蛋白进行基于GO分析的生物学过程、 细胞组分和分子功能方面的富集分析； 使用NCBI的blast工具对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取斑马 鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质，以evahuKO. 001作为卡值。以筛选出治疗神经 元损伤的预后蛋白标志物； 使用MetaCore软件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功能相关通路。2. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，其中，步骤1采用吗替麦考酚酯作为 中枢系统神经毒性诱导剂，诱导建立斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型，并选择模型组、空白 组、模型给药组和空白给药组四组对照，每组选用30-150尾斑马鱼。3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，其中，步骤2所述药物处理，方法如 下： 除空白组外其余各组均用0. 25-0. 4μΜ吗替麦考酚酯造神经损伤模型。选用AB系Id的胚胎斑马鱼，用0. 25-0. 4μΜ吗替麦考酚酯和药物同时处理12-24h，药物样品分别用 0. 1-0. 3%DMS0溶解至所需浓度。4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，其中，步骤3,各组提取总蛋白；方法 如下： 蛋白质提取：分别对上述四组斑马鱼加入300-800μ1裂解液于离心管中碾磨， 置于冰上裂解10-20min，超声2-5min，再置于冰上裂解10-20min，裂解后，在0-4°C下 10, 000-15,OOOrpm离心5min，取上清分装于离心管中并置于-80°C，蛋白质的酶解：用超 滤方法将上述蛋白溶液替换成蛋白溶解液，并用bradford方法定量，每组分别取30-80ug 加入1 %十二烷基硫酸钠luL充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，混匀，60°C反应1小 时；加入半胱氨酸封闭试剂1μL，室温反应10分钟；按照酶：蛋白质=1 :50的比例加入 trypsin-胰蛋白酶，35-40°C酶解过夜， 化学标记：选择使用iTRAQ，双相电泳分离分析、差异荧光凝胶电泳分析方法对酶切后 的蛋白进行标记； 使用高效液相色谱仪对各蛋白进行分离：其中的高效液相色谱仪选自：Agilentl200 ;Agilent1100 色谱柱：选择250X4. 6mmC18填料任意品牌的反相色谱柱； 流动相：A相：2%ACN-98%H20(氨水调pH10. 0);B相：98%ACN-2%H20(氨水调pH 10.0), 溶剂梯度：5% -8%B，2min;8% -32%B，24min;32% -95%B，26min;95%，33min; 95% -5%B,35min； 柱温：40-50°C; 流速：〇. 5-0. 8mL/min； 检测波长：210-220nm。5. 根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，其中，所述化学标记，选择使用iTRAQ 进行化学标记，各管标记试剂中加入70μL乙醇，混匀，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；室 温反应一小时，标记后混合四组标记好的样本；冻干备用。6. 根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，其中，所述 高效液相色谱仪为：高pH反相色谱仪：分离方法如下：将混合标记好的样品100μg用 50μL流动相A进行溶解，并采用高效液相色谱仪250X4. 6mmC18反相柱进行液相分离，提 取总蛋白；每分钟一管组分收集，在6%-35%有效梯度内，共30组分；将30个馏分，真空干 燥备用；其中，高效液相色谱仪色谱条件 (1) 流动相： 八相，2%八^98%!120(氨水调？!110.0); B相：98%ACN-2%H20 (氨水调pH10. 0)， (2) 溶剂梯度： 5 % -8 %B,lmin；8 % -32 %B, 25min；32 % -95 %B, 27min；95 %, 31min；95 % -5 %B, 32min； (3) 柱温：45°C; (4) 流速：0· 7mL/min; (5) 检测波长：214nm。7. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，其中，步骤4所述质谱上样分析，方法 如下：取各样本，溶解于流动相A合并为10个组分，10, 000-15, 000r离心2-5min，取上清液 并采用Eksigent液相-ABSCIEXTripleT0F?5600质谱仪检测；其中液相的色谱条件： 液相：EksigentNanoLC2Dplus； 富集柱：自制C18,5um，ID100um，20mmLength; 分离柱：自制C18,3um，ID75um，120mmLength; 流动相：A相，1. 9%ACN-98%H20-0. 1%FA; B相，98%ACN-1. 9%H20-0. 1%FA; 洗脱条件：5% -12%B，5min;12% -22%B，21min;22% -32%B，31. 5min;32% -90%， 36min;90% -5%B，40min;流速：330nl/min; 其中质谱条件：数据采集时间：40min，喷雾电压：2. 3KV;毛细管温度：23. 92°C;碰撞能 量：45eV;采集质量范围：350-1250Da， 质谱鉴定：采用质谱分析数据ProteinPilot?SoftwareBeta软件对NCBInr数据库进 行检索鉴定蛋白；合并搜库，导出数据用TOST软件分析；同时用m/z报告离子的峰面积积 分进行相对定量分析。8. 根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于，其中，质谱上样分析中，富集柱：可以 选择C18,5um，ID100um，20mmLength;分离柱：可以选择C18,3um，ID75um，120mmLength;流 速：300-350nl/min;质谱条件：喷雾电压：2. 0 - 2. 5KV;毛细管温度：20-25°C;碰撞能量： 40-50eV;采集质量范围：350-1250Da。9. 用权利要求1的分析方法筛选药物的方法，所述方法步骤如下： 步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组； 步骤2,药物组分别用被试药物和阳性药物进行药物处理； 步骤3,各组提取总蛋白； 用蛋白质裂解液裂解，再进行酶解，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；用高效液相色谱 仪高pH反相色谱分离总蛋白； 步骤4,质谱上样分析 采用质谱分析数据ProteinPilot? Software Beta软件对NCBInr数据库进行检索鉴 定蛋白；合并搜库，导出数据用TOST软件分析， 同时用m/z对各组报告离子的峰面积积分进行相对定量分析；鉴定蛋白的组间比值>1. 5或〈0. 5被认为存在表达差异。10. 根据权利要求9的筛选药物的方法，所述方法中步骤2的药物组使用被试药物进行 实验，获得的结果如果和阳性药物相同，即认为该药物具有和阳性药物相同的药效。
【专利摘要】本发明涉及一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1.斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；步骤2.药物组用药物处理；步骤3.各组提取总蛋白；步骤4.质谱上样分析；步骤5.生物信息学分析。
【IPC分类】G01N27/62, G01N30/02
【公开号】CN105467022
【申请号】CN201410452370
【发明人】佟玲, 李晓稳, 李东翔, 陈楠, 孙万阳, 周水平, 朱永宏
【申请人】天士力制药集团股份有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月5日