制备克隆小型动物胚胎的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物细胞工程技术领域。具体地，本发明涉及制备克隆小型动物胚胎 的方法。
【背景技术】
[0002] 体细胞核移植又称克隆，是动物细胞工程中最常用的技术手段。通过电击法或直 接显微注射法将具有较高分化程度的体细胞转移至卵母细胞中，再经过化学激活，使其重 新编程发育成胚胎，将其移植入代孕母体内，出生完整个体。1996年通过传统克隆技术，在 显微操作仪器辅助下，首次获得的体细胞克隆绵羊。2001年，科学家GavorVajta首次提出 了手工克隆技术，该技术在体视显微镜下，手持特制刀片将无透明带卵母细胞的核切除，从 而达到去核目的。手工克隆与传统克隆相比，无需使用显微操作仪，及尖端的技术人员。但 这些技术方法主要适用于大动物。
[0003] 因而，现阶段适于小型动物的手工克隆技术的研究具有重大的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的 一个目的在于提出一种适于小型动物，并能够有效保证囊胚形成率的手工克隆技术。
[0005] 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备克隆小型动物胚胎的方法。 根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：提供离体的供体核细胞；提供离体的卵母细 胞；于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将所述卵母细胞进行去核处理，以便获得去 核卵母细胞；将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，以便获得重构胚；将所述重构 胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚；以及将所述激活的重构胚进行培养，以便获得所 述克隆小型动物胚胎。发明人惊奇的发现，采用本发明的方法，能够在透明带为半消化状 态，即在消化透明带的同时，适时快速进行切割去核，从而操作人员可以精确的把握去核时 间，成功实现卵母细胞去核，并保证囊胚形成率，高效制备克隆小型动物胚胎。此外，根据本 发明的实施例，本发明的方法成本低、操作简单，易于推广。
[0006] 根据本发明的实施例，本发明制备克隆小型动物胚胎的方法还可以进一步具有下 列附加技术特征：
[0007] 根据本发明的实施例，所述透明带消化剂为选自链蛋白酶和细胞松弛素B的至少 一种。由此，能够有效消化透明带，便于精准的把握去核时间，易于去核操作。
[0008] 根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：5-15i!g/mL链蛋白酶；和/或 1-5yg/mL细胞松弛素B。由此，透明带半消化效果较好，易于去核操作。
[0009] 根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：IOyg/mL链蛋白酶；和/或 2. 5yg/mL细胞松弛素B。由此，透明带半消化效果好，易于去核操作。
[0010] 根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中进一步包含：5-15体积％的TCM199 培养基；〇? 1-0. 3mg/mL碳酸氢钠；0? 1-0. 3mg/mL丙酮酸钠；3-4mg/mL赫佩斯钠盐；2-3mg/ mL赫佩斯酸；0. 1-0. 3mg/mL谷氨酰胺；以及15-25体积％的牛血清。由此，能够有效提高卵 母细胞去核后的成活率。
[0011] 根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：1〇体积％的TCM199培养基； 0? 17mg/mL碳酸氢钠；0? 20mg/mL丙酮酸钠；3. 60mg/mL赫佩斯钠盐；2. 63mg/mL赫佩斯酸； 0. 20mg/mL谷氨酰胺；以及20体积％的牛血清。由此，去核过程中，卵母细胞损伤小，能够 有效提高卵母细胞去核后的成活率。
[0012] 根据本发明的实施例，当所述卵母细胞的透明带半消化时，根据极体定位的方法， 将所述卵母细胞的第一极体连同部分卵母细胞质切除，以便实现所述去核处理。由此，能够 适时快速进行切割去核，操作简单，对细胞损伤小，去核成功率高。
[0013] 根据本发明的实施例，将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，包括：将所 述去核卵母细胞均分为两组；将其中一组去核卵母细胞与所述供体核细胞进行第一融合， 以便形成去核卵母细胞-体细胞复合体；以及将另一组去核卵母细胞与所述去核卵母细 胞-体细胞复合体进行第二融合，以便形成三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母 细胞，所述三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞即为所述重构胚。由此，融合 效果好，重构胚的成活率高，进而能够有效提高囊胚形成率。
[0014] 根据本发明的实施例，利用细胞融合仪，于融合操作液中进行所述第一融合和 所述第二融合，其中，所述融合操作液包含：54. 65mg/mL甘露醇；lmg/mL聚乙烯醇；以及 0. 145mg/mL硫酸镁，所述细胞融合仪的参数设置为DC80V、40iis、AC9V。由此，能够促进细 胞融合，并进一步提高囊胚形成率。
[0015] 根据本发明的实施例，将所述重构胚置于化学激活操作液中，于37°C、5%的二氧 化碳培养箱中培养4-8小时，优选6小时，以便实现所述体外激活，其中，所述化学激活操作 液包含：4. 789mg/mL氯化钠；0. 36mg/mL氯化钾；0. 159mg/mL磷酸钾；0. 291mg/mL七水硫酸 镁；2.lmg/mL碳酸氢钠；lmg/mL葡萄糖；0? 029mg/mL丙酮酸钠；0? 146mg/mL谷氨酰胺；0? 37 体积％的乳酸钠（60%糖楽）；0. 038mg/mL乙二胺四乙酸；0.lmg/mL聚乙烯醇；5mg/mL牛血 清白蛋白；5yg/mL细胞松弛素B;以及2. 666mg/mL六水氯化锶。由此，能够有效激活重构 胚，进而促进囊胚形成，提高囊胚形成率。
[0016] 根据本发明的实施例，将所述激活的重构胚置于胚胎培养液中，于37°C、5%的二 氧化碳培养箱中培养100-120小时优选108小时，以便获得所述克隆小鼠胚胎，其中，所述 胚胎培养液包含：4. 789mg/mL氯化钠；0. 36mg/mL氯化钾；0. 159mg/mL磷酸钾；0. 291mg/mL 七水硫酸镁；2.lmg/mL碳酸氢钠；lmg/mL葡萄糖；0. 029mg/mL丙酮酸钠；0. 251mg/mL二水 氯化I丐；〇? 146mg/mL谷氨酰胺；0? 37体积％的乳酸钠；0? 038mg/mL乙二胺四乙酸；0?Img/ mL聚乙烯醇；以及5mg/mL牛血清白蛋白。由此，能够有效促进激活后的重构胚发育形成囊 胚，提高囊胚形成率。
[0017] 根据本发明的实施例，所述小型动物为哺乳动物，优选为鼠科、兔科、猫科、或犬科 的至少一种，更优选为小鼠。
【附图说明】
[0018]图1是根据本发明一个实施例，切割未消化透明带细胞，去核刀未触碰到卵母细 胞胞质中细胞核的部分的显微镜示意图；
[0019] 图2是根据本发明一个实施例，切割未消化透明带细胞，去核刀暴力挤压下，透明 带中卵母细胞胞质涣散，卵母细胞死亡的显微镜示意图；
[0020] 图3是根据本发明一个实施例的去核操作盘示意图；
[0021] 图4是根据本发明一个实施例的融合操作盘示意图；
[0022] 图5是根据本发明一个实施例的培养盘TK意图；
[0023] 图6是根据本发明一个实施例，小鼠第二次减数分裂中期卵母细胞的显微图片；
[0024] 图7是根据本发明一个实施例，CF-C细胞系小鼠供体核细胞，在200倍倒置相差 显微镜条件下的显微图片；
[0025] 图8是根据本发明一个实施例，半消化透明带条件下，去核刀切割含有细胞核部 分的卵母细胞胞质的显微图片；
[0026] 图9是根据本发明一个实施例，小鼠手工克隆重构胚培养108小时后形成的囊胚， 在20倍体视显微镜条件下的显微图片；以及
[0027] 图10是根据本发明一个实施例，小鼠手工克隆重构胚培养108小时后形成的囊 胚，在56倍体视显微镜条件下的显微图片。
【具体实施方式】
[0028] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本 发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0029] 在本发明的描述中，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗 示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特 征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，"多个"的含义是至少两 个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0030] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0031] 发明人发现，与猪牛羊等大动物相比，小型动物的卵子体积小，胞质也较为脆弱， 在按照现有技术去除卵母细胞核的操作过程中，去核刀如果直接挤压未经过预处理的透明 带，会出现以下两种情况：情况一：卵母细胞翻滚，去核刀未触碰到卵母细胞胞质中细胞核 的部分（如图1所示）；情况二：去核刀暴力挤压，导致透明带中卵母细胞胞质涣散，卵母细 胞死亡（