g/mL、磷酸钾：0? 162mg/mL、七水硫酸镁：0? 293mg/mL、碳酸氢钠：0? 349mg/mL、赫佩 斯钠盐：4.96911^/1]11、乳酸钠（60%糖楽）：4.34911^/1]11、丙酮酸钠 ：0.03611^/1]11、葡萄糖： lmg/mL、牛血清白蛋白：4mg/mL、青霉素G盐钾：0? 06mg/mL、硫酸链霉素：0? 05mg/mL、酉分红： 0.Olmg/mL；
[0056]卵母细胞去核液（CBMP) :TCM199 培养基[10X] :10%v/v、碳酸氢钠：0? 17mg/mL、 丙酮酸钠：〇? 20mg/mL、赫佩斯钠盐：3. 60mg/mL、赫佩斯酸：2. 63mg/mL、谷氨酰胺：0? 20mg/ mL、链蛋白酶（Pronase) :IOiig/mL、细胞松弛素（CB) :2. 5iig/mL、牛血清：20% ;
[0057] 电融合操作液（PFM):甘露醇：54. 65mg/mL、聚乙烯醇：lmg/mL、硫酸镁：0? 145mg/ mL；
[0058] 化学激活操作液：氯化钠：4. 789mg/mL、氯化钾：0? 36mg/mL、磷酸钾：0? 159mg/mL、 七水硫酸镁：〇. 291mg/mL、碳酸氢钠：2.lmg/mL、葡萄糖：lmg/mL、丙酮酸钠：0. 029mg/mL、谷 氨酰胺：0.1461^/1^、乳酸钠（60%糖浆）：0.37%、乙二胺四乙酸 ：0.03811^/1^、聚乙烯醇： 0?lmg/mL、牛血清白蛋白：5mg/mL、细胞松弛素B(CB) :5ug/mL、六水氯化银：2. 666mg/mL;
[0059]胚胎培养液（CZB):氯化钠：4. 789mg/mL、氯化钾：0? 36mg/mL、磷酸钾：0? 159mg/ mL、七水硫酸镁：0? 291mg/mL、碳酸氢钠：2.lmg/mL、葡萄糖：lmg/mL、丙酮酸钠：0? 029mg/ mL、二水氯化钙：0? 251mg/mL、谷氨酰胺：0? 146mg/mL、乳酸钠（60%糖浆）：0? 37%、乙二胺 四乙酸：0? 038mg/mL、聚乙烯醇：0?lmg/mL、牛血清白蛋白：5mg/mL;
[0060] 其它试剂：磷酸盐缓冲液（PBS)、0.05%胰蛋白酶（Trysin)、200mg/L乙二胺四乙 酸（EDTA)、明胶、植物凝集素（PHA)、细胞松弛素B(CB)、放线菌酮、透明质酸酶（Hya)、孕马 血清促性腺激素（PMSG)、人绒毛膜促性腺激素（hCG)。
[0061] -般方法：
[0062] 根据本发明的实施例的制备克隆小型动物胚胎的方法，一般包括以下步骤：
[0063] 1、提供离体的供体核细胞
[0064] 雌雄动物交配，断颈处死怀孕雌性动物，取出子宫内胎儿。采用组织建系法进行 CF-C细胞系建系，用供体核细胞培养液对供体细胞进行培养，克隆操作前1小时，收集生长 良好的供体核细胞，将其转移至离心管中，得到供体核细胞。
[0065] 2、提供离体的卵母细胞
[0066] 处死排卵期的雌性动物，剪下与卵巢段连接的输卵管，显微镜下，挑破输卵管膨大 部，用卵母细胞采集液收集卵丘卵母细胞复合体（COCs)，得到卵母细胞。
[0067] 3、卵母细胞去核
[0068]使用卵母细胞操作液（M2)配制的并含5iig/mL细胞松弛素B(CB)和10iig/mL链 蛋白酶（Pronase)的卵母细胞去核液（CBMP)将小鼠卵母细胞的透明带半消化，用去核刀切 除卵母细胞核，得到去核卵母细胞。
[0069] 4、细胞融合
[0070] 将去核的卵母细胞胞质与供体体细胞放置于650iim宽度的融合槽内，用电融合 操作液（PFM)，在DC80V、40iis的电融合参数下，采用一次电融合法将三者融合，形成重构 胚。
[0071] 5、激活重构胚
[0072] 将重构胚置于胚胎培养基（CZB)中，在37°C、5%二氧化碳培养箱里培养1小时后 取出，然后转入化学激活操作液，37°C、5 %二氧化碳培养箱内，激活6小时，获得激活的重 构胚。
[0073] 6、形成囊胚
[0074] 然后将激活的重构胚转入胚胎培养基（CZB)，形成空中空（WOW)系统，37°C、5%二 氧化碳培养箱内培养108小时，观察并收集囊胚，最终获得体外手工克隆小型动物胚胎。
[0075] 实施例1
[0076] 根据本发明的制备克隆小型动物胚胎的方法，按照以下步骤，制备克隆小鼠胚 胎：
[0077] 1、动物超数排卵
[0078] 室温下，6只7-8周龄的昆明品系母鼠，腹腔给药IOIU的孕马血清促性腺激素 (PMSG)，48小时后腹腔注射IOIU的人绒毛膜促性腺激素（hCG)。
[0079] 2、细胞采集
[0080] 注射hCG13小时后，断颈处死6只母鼠，剪下与卵巢段连接的输卵管，显微镜下，挑 破输卵管膨大部，用卵母细胞采集液收集卵丘卵母细胞复合体（COCs)共256个。
[0081] 其中卵母细胞采集液的体成份如下：10%v/vTCM199培养基（IOX)、0? 17mg/mL 碳酸氢钠、〇. 20mg/mL丙酮酸钠、3. 60mg/mL赫佩斯钠盐、2. 63mg/mL赫佩斯酸、0. 20mg/mL谷 氨酰胺、3. 00iig/m两性霉素B、30IU/m肝素钠和2体积％牛血清；
[0082] 将COCs放入含有透明质酸酶（Hya)的卵母细胞操作液（M2)滴中，将卵丘细胞脱 落后的卵母细胞在M2中洗涤3遍后，转移至去核操作盘内的M2滴中，得到227枚脱去卵丘 细胞的卵母细胞。
[0083] 其中卵母细胞操作液（M2)的成份如下：5. 533mg/mL氯化钠、0? 356mg/mL氯化钾、 0? 252mg/mL二水氯化|丐、0. 162mg/mL磷酸钾、0? 293mg/mL七水硫酸镁、0? 349mg/mL碳酸氢 钠、4.969111〖/111]^赫佩斯钠盐、4.34911^/1111^乳酸钠（60%糖楽）、0.03611^/111]^丙酮酸钠、111^/1111 葡萄糖、4mg/mL牛血清白蛋白、0. 06mg/mL青霉素G盐钾、0. 05mg/mL硫酸链霉素和0.Olmg/ mL酉分红。
[0084] 3、供体核细胞制备
[0085] 供体核细胞系建系：CF-I雄鼠与C57雌鼠交配，断颈处死怀孕12. 5天的母鼠，取 出子宫内胎儿，采用组织建系法进行CF-C细胞系建系，用供体核细胞培养液对供体细胞进 行培养，供体细胞如图7所示。
[0086] 其中供体核细胞培养液的成份如下：高糖DMEM细胞培养基、15体积％的牛血清、 IX非必需氨基酸和lOng/mLb成纤维细胞生长因子（bFGF)。
[0087] 供体核细胞准备：克隆操作前1小时，选择24孔板中培养的生长汇合率达90%的 核供体细胞培养孔，〇. 05%胰蛋白酶（Trysin)消化细胞，供体核细胞培养液终止消化，轻 微吹打后，将液体转移至I. 5mL离心管中。
[0088] 4、卵母细胞去核
[0089] 将步骤3中获得的227枚脱去卵丘细胞的卵母细胞转移至卵母细胞去核液（CBMP) 中，采用极体定位法，将第一极体连同部分卵母细胞质切除，如图8所示，得到172个去核的 卵母细胞胞质；
[0090]其中卵母细胞去核液（CBMP)的成份如下：10 %v/vTCM199培养基（10X)、 0. 17mg/mL碳酸氢钠、0. 20mg/mL丙酮酸钠、3. 60mg/mL赫佩斯钠盐、2. 63mg/mL赫佩斯酸、 0? 20mg/mL谷氨酰胺、10iig/mL链蛋白酶（Pronase)、2. 5iig/mL细胞松弛素（CB)和20体 积％牛血清。
[0091] 将上述去核的卵母细胞转移至卵母细胞操作液滴M2中待用。
[0092] 5、卵母细胞与供体细胞融合
[0093] 将步骤3中移至I. 5ml离心管的体细胞置于融合操作盘的M2滴中，呈单个细胞分 布状；
[0094] 将步骤4中获得的去核卵母细胞按数量平均分成两部分，分别转移至如图4所示 的融合操作盘的2号和3号M2滴中待用；
[0095] 将2号M2滴中的去核卵母细胞转移至上述lmg/mL植物凝集素（PHA)滴中，放置 1-2秒后迅速将其移至上述含体细胞的M2操作滴中，挑选单个体细胞与之贴合，形成去核 卵母细胞-体细胞复合体84个；
[0096] 将去核卵母细胞-体细胞复合体转移到融合操作液（PFM)滴中平衡5秒。其中电 融合操作液（PFM)的成份如下：54. 65mg/mL甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇和0. 145mg/mL硫酸 镁。
[0097] 然后将平衡后的去核卵母细胞-体细胞复合体转移至载有融合操作液的电极融 合槽中，细胞融合仪参数为DC80