V、40iis、AC9V，同时将3号M2滴中剩余的另一半去核卵母 细胞经过PFM滴平衡后也转移到该电极融合槽中，并悬挂于去核卵母细胞-体细胞复合体 下，形成去核卵母细胞_体细胞-去核卵母细胞的三体结构，进行电击，然后将该三体结构 转移到融合操作盘的最后一排M2滴中；
[0098] 将上述去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞三体结构转入图5所示的培养盘中 的2号胚胎培养液（CZB)孔中，置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养1小时，以便于该三体 结构融合成一体，形成单个重构胚结构。84个去核卵母细胞-体细胞复合体中，最终成功获 得57个单个重构胚结构。
[0099]6、激活重构胚以形成囊胚
[0100] 从培养箱中取出图5所示的培养盘，将重构胚转移至培养盘的1号化学激活操作 液孔中，置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养6小时，进行化学激活。
[0101] 其中化学激活操作液的成份如下：4. 789mg/mL氯化钠、0. 36mg/mL氯化钾、 0.159111〖/1111磷酸钾、0.29111^/1111七水硫酸镁、2.111^/1111碳酸氢钠、111^/1111葡萄糖、0.02911^/ mL丙酮酸钠、0. 146mg/mL谷氨酰胺、0. 37%乳酸钠（60%糖楽）、0. 038mg/mL乙二胺四乙酸、 0?lmg/mL聚乙烯醇、5mg/mL牛血清白蛋白、5iig/mL细胞松弛素B(CB)和2. 666mg/mL六水 氯化锶。
[0102] 将培养盘的3号和4号孔用打孔针打孔，形成孔中孔（WOW)结构。将重构胚从培 养盘的1号化学激活操作液孔中移出，移至2号孔清洗5秒钟，然后将上述57枚重构胚胎 平均分配至3号和4号孔的小孔内，加入胚胎培养液（CZB)，置于37°C、5%二氧化碳培养箱 中培养108小时，形成囊胚，囊胚形态如图9和图10所示（观察到13个囊胚）。
[0103] 其中胚胎培养液（CZB)的成份如下：4. 789mg/mL氯化钠、0. 36mg/mL氯化钾、 0.159111〖/1111磷酸钾、0.29111^/1111七水硫酸镁、2.111^/1111碳酸氢钠、111^/1111葡萄糖、0.02911^/ 1^丙酮酸钠、0.25111^/1111二水氯化|15、0.14611^/1111谷氨酰胺、0.37%乳酸钠（60%糖楽）、 0? 038mg/mL乙二胺四乙酸、0?lmg/mL聚乙烯醇和5mg/mL牛血清白蛋白。
[0104] 重复进行本实施例的实验31次，共收集到488个卵巢，5308个卵子，最终获得350 个囊胚，平均囊胚率达高到29 %。
[0105]
[0106] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0107] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种制备克隆小型动物胚胎的方法，其特征在于，包括以下步骤： 提供离体的供体核细胞； 提供离体的卵母细胞； 于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将所述卵母细胞进行去核处理，以便获得 去核卵母细胞； 将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，以便获得重构胚； 将所述重构胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚；以及 将所述激活的重构胚进行培养，以便获得所述克隆小型动物胚胎。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透明带消化剂为选自链蛋白酶和细 胞松弛素B的至少一种。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核液中包含： 5-15iig/mL链蛋白酶；和/或 1- 5 ii g/mL细胞松弛素B。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核液中包含： 10. ii g/mL链蛋白酶；和/或 2. 5 ii g/mL细胞松弛素B。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核液中进一步包含： 5-15体积％的TCM199培养基； 0? 1-0. 3mg/mL 碳酸氢钠； 0? 1-0. 3mg/mL 丙酮酸钠； 3-4mg/mL赫佩斯钠盐； 2- 3mg/mL赫佩斯酸； 0? 1-0. 3mg/mL谷氨酰胺；以及 15-25体积％的牛血清。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核液中包含： 10体积％的TCM199培养基； 0. 17mg/mL碳酸氢钠； 0? 20mg/mL丙酮酸钠； 3. 60mg/mL赫佩斯钠盐； 2. 63mg/mL赫佩斯酸； 0? 20mg/mL谷氨酰胺；以及 20体积％的牛血清。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述卵母细胞的透明带半消化时，根据 极体定位的方法，将所述卵母细胞的第一极体连同部分卵母细胞质切除，以便实现所述去 核处理。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞 融合，包括： 将所述去核卵母细胞均分为两组； 将其中一组去核卵母细胞与所述供体核细胞进行第一融合，以便形成去核卵母细 胞-体细胞复合体；以及 将另一组去核卵母细胞与所述去核卵母细胞-体细胞复合体进行第二融合，以便形成 三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞，所述三体结构的去核卵母细胞-体细 胞-去核卵母细胞即为所述重构胚。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用细胞融合仪，于融合操作液中进行所 述第一融合和所述第二融合， 其中， 所述融合操作液包含： 54. 65mg/mL 甘露醇； lmg/mL聚乙烯醇；以及 0? 145mg/mL 硫酸镁， 所述细胞融合仪的参数设置为DC80V，40 ii s，AC9V。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述重构胚置于化学激活操作液中， 于37°C、5%的二氧化碳培养箱中培养4-8小时，优选6小时，以便实现所述体外激活， 其中，所述化学激活操作液包含： 4. 789mg/mL 氯化钠； 0. 36mg/mL 氯化钾； 0? 159mg/mL 憐酸钾； 0? 291mg/mL七水硫酸镁； 2. lmg/mL碳酸氢钠； lmg/mL葡萄糖； 0. 029mg/mL丙酮酸钠； 0? 146mg/mL谷氨酰胺； 0.37体积％的乳酸钠； 0. 038mg/mL乙二胺四乙酸； 0? lmg/mL聚乙烯醇； 5mg/mL牛血清白蛋白； 5. ii g/mL细胞松弛素B ;以及 2. 666mg/mL六水氯化银， 任选地，将所述激活的重构胚置于胚胎培养液中，于37°C、5 %的二氧化碳培养箱中培 养100-120小时优选108小时，以便获得所述克隆小鼠胚胎， 其中，所述胚胎培养液包含： 4. 789mg/mL 氯化钠； 0. 36mg/mL 氯化钾； 0? 159mg/mL 憐酸钾； 0? 291mg/mL七水硫酸镁； 2. lmg/mL碳酸氢钠； lmg/mL葡萄糖； 0. 029mg/mL丙酮酸钠； 0? 251mg/mL 二水氯化?丐； 0? 146mg/mL谷氨酰胺； 0.37体积％的乳酸钠； 0. 038mg/mL乙二胺四乙酸； 0? lmg/mL聚乙烯醇；以及 5mg/mL牛血清白蛋白， 任选地，所述小型动物为哺乳动物，优选为鼠科、兔科、猫科、或犬科的至少一种，更优 选为小鼠。
【专利摘要】本发明公开了制备克隆小型动物胚胎的方法，其包括以下步骤：提供离体的供体核细胞；提供离体的卵母细胞；于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将卵母细胞进行去核处理，以便获得去核卵母细胞；将去核卵母细胞与供体核细胞融合，以便获得重构胚；将重构胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚；以及将激活的重构胚进行培养，以便获得克隆小型动物胚胎。采用本发明的方法，能够在消化卵母细胞透明带的同时，适时快速进行切割去核，从而操作人员可以精确的把握去核时间，成功实现卵母细胞去核，并保证囊胚形成率，高效制备克隆小型动物胚胎。
【IPC分类】C12N15/877
【公开号】CN105087653
【申请号】CN201410189550
【发明人】陈玉, 李杏, 李林, 杨珍珍, 杜玉涛
【申请人】深圳华大方舟生物技术有限公司, 深圳华大基因科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月6日