具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽、多肽组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽、多肽组合物及其应用，尤其涉及具有黏附拮抗活性的拟态弧菌 OmpU黏附素蛋白结合肽、多肽组合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 拟态弧菌（Vibriomimicus)是水产养殖生产中常见的一种肠道病原菌，主要经肠 黏膜感染引起鱼类腹水病，严重威胁水产养殖业的健康发展。目前控制鱼类腹水病的主要 手段是抗菌治疗，但是随着抗菌药物的长期使用，细菌产生耐药性，不仅导致治疗效果不明 显，而且影响水产品质量，还存在公共卫生隐患。因此，亟需研发不产生耐药性的新型抗拟 态弧菌感染的药物。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU 黏附素蛋白结合肽以及多肽组合物，并利用该结合肽和多肽组合物能与OmpU黏附素蛋白 发生特异性结合，从而有效地抑制拟态弧菌通过该黏附素黏附定植于肠黏膜表面，进而达 到消减拟态弧菌毒力的作用。
[0004] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案之一如下：
[0005] -种具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽，本拟态弧菌OmpU黏 附素蛋白结合肽由下述氨基酸序列SEQIDNO: 1组成：
[0006] Asn-Cys-Thr-Asp-Lys-Leu-Cys-Leu-Leu-Pr〇-Pr〇-Val〇
[0007] 本发明还保护上述制备的具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽 在制备拟态弧菌黏附拮抗剂中的应用。
[0008] 进一步的，由具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽制备的拟态 弧菌黏附拮抗剂应用于拮抗拟态弧菌黏附，该鲤鱼上皮瘤细胞即EPC细胞，是一种黏附模 式细胞。
[0009] 进一步的，由具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽制备的拟态 弧菌黏附拮抗剂应用于防治草鱼腹水病。
[0010] 本发明采用的技术方案之二如下：
[0011] -种具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽的组合物，本组合物 由如下三种多肽组成：
[0012] 1)SEQIDN0:1
[0013] Asn-Cys-Thr-Asp-Lys-Leu-Cys-Leu-Leu-Pr〇-Pr〇-Val；
[0014] 2)SEQIDNO: 2
[0015] Thr-Trp-Thr-Cys-Ser-Asp-Val-Ile-Cys-Thr-Ala-Arg；
[0016] 3)SEQIDNO: 3
[0017] Ser-Cys-Thr-Ser-Pro-His-Cys-Phe-Met-Trp-Leu-Pro;
[0018] SEQIDNO: 1所示多肽、SEQIDNO:2所示多肽、SEQIDNO:3所示多肽三者的质 量配比为1:1:1。
[0019] 本发明还保护上述制备的具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽 的组合物在制备拟态弧菌黏附拮抗剂中的应用。
[0020] 进一步的，由具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽组合物制备 的拟态弧菌黏附拮抗剂应用于拮抗拟态弧菌黏附鲤鱼上皮瘤细胞。
[0021] 进一步的，由具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽组合物制备 的拟态弧菌黏附拮抗剂应用于防治草鱼腹水病。
[0022] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
[0023] 1)、作为一种肠道病原菌，拟态弧菌通过黏附素黏附定植于肠黏膜表面是引发感 染的关键起始环节。外膜蛋白U(0utermembraneproteinU，OmpU)是拟态弧菌的重要黏 附素蛋白，也是抗拟态弧菌毒力的潜在药物作用靶点。本发明提供了具有黏附拮抗活性的 OmpU黏附素蛋白结合肽及其多肽组合物，此具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白结合肽 及其多肽组合物不但可与OmpU黏附素蛋白发生特异性结合，而且能够有效地抑制拟态弧 菌通过该黏附素黏附定植于肠黏膜表面，进而达到消减拟态弧菌毒力的作用。
[0024] 进而，由具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白结合肽及其多肽组合物制成的黏 附拮抗剂，能够有效地防治拟态弧菌引起的鱼类腹水病。
[0025] 2)、近年来，生物肽库技术的建立与完善为研究生物活性肽提供了有效手段。噬菌 体随机肽库是将大量外源多肽基因与噬菌体衣壳蛋白pill融合表达并展示在噬菌体表面 形成的巨大随机肽库，被展示的多肽保持着相对独立的空间结构和生物活性。利用目标靶 分子与展示多肽间的特异性亲和力，即可将感兴趣的蛋白或多肽从噬菌体随机肽库中筛选 出来，并且在得到目标多肽氨基酸序列的同时获得其编码基因。与其他肽库技术相比，噬菌 体随机肽库技术具有快捷、高通量、多肽表型与基因型一致等特点，已被广泛应用于抗原表 位分析、功能性短肽和肽类药物筛选、蛋白质互作位点分析等研究领域。
[0026] 本发明中提供了三种能与拟态弧菌OmpU黏附素蛋白特异性结合的多肽（均为 十二肽），三种多肽的氨基酸序列分别如序列表中的SEQIDN0:USEQIDN0:2和SEQIDN0:3所 示。采用的技术方案是选择噬菌体随机十二肽库，以拟态弧菌OmpU黏附素蛋白为靶标，通 过亲和淘选方法从中筛选出3个与OmpU黏附素蛋白结合的阳性噬菌体克隆，经间接ELISA 法和竞争抑制ELISA法确定该3个阳性噬菌体克隆表面展示的三种OmpU黏附素蛋白结合 肽均可与OmpU黏附素蛋白发生特异性结合。
[0027] 本发明提供的三种OmpU黏附素蛋白结合肽均具有黏附拮抗活性，能够阻断或抑 制OmpU黏附素蛋白黏附EPC细胞，也能抑制拟态弧菌黏附EPC细胞，三种多肽（SEQIDN0:1、 SEQIDN0:2和SEQIDN0:3)对拟态弧菌的平均黏附抑制率分别为92. 8± 1. 97 %、 83. 2 ±4. 03 %和74. 5 ±3. 25%。采用的技术方案是选择EPC细胞作为细胞黏附模型，以兔 抗rOmpU纯化抗体（本实验室制备）为一抗，FITC标记羊抗兔IgG(商品化购买）为二抗， 利用细胞免疫荧光技术证实SEQIDN0:1结合肽能够阻断OmpU黏附素蛋白与EPC细胞结合， SEQIDN0:2和SEQIDN0:3结合肽能够明显抑制OmpU黏附素蛋白与EPC细胞结合。同时通过 肽黏附抑制试验证实三条结合肽能够显著抑制拟态弧菌对EPC细胞的黏附。
[0028] 本发明提供的三种OmpU黏附素蛋白结合肽与OmpU黏附素蛋白的亲和力强，通 过非竞争ELISA法（Beatty法）测得三种多肽（3￡〇10勵：1、3￡〇10勵:2和3￡〇10勵:3) 的亲和常数分别为（1. 24±0. 56)X109L/moL(Pl)、（6. 17±0. 19)X10sL/moL(P2)和 (6. 15±0. 71)X10sL/moL(P3)。
[0029] 3)、本发明中的三种多肽（SEQIDN0:1、SEQIDN0:2和SEQIDN0:3)均可通过常规技 术如化学合成、基因克隆表达等方法制备。用医药领域常用的纳微球材料（明胶、羟基磷灰 石、聚乳酸、壳聚糖、海藻酸等）包裹其中一种多肽或三种多肽即多肽组合物而制成的口服 黏附拮抗剂，均可用于由拟态弧菌感染引起的鱼类腹水病的防治，因此本发明为鱼类腹水 病的防治提供了新途径，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0030] 图1为间接ELISA初步鉴定与OmpU黏附素蛋白特异性结合的阳性噬菌体克隆。图 1 中有 10 个克隆，分别命名为Pl、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9 和P10。
[0031] 图2a、2b分别为竞争抑制ELISA进一步鉴定与OmpU黏附素蛋白特异性结合的阳 性噬菌体克隆。
[0032] 图3为结合肽对OmpU黏附素蛋白黏附EPC细胞的拮抗作用。
[0033] 图4为结合肽对拟态弧菌黏附EPC细胞的拮抗作用。
[0034] 图5a、5b、5c分别为黏附拮抗肽Pl、P2、P3与OmpU黏附素蛋白的结合反应曲线。
【具体实施方式】
[0035] 为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需特 别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。
[0036] 下述说明中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实验方法中的所述试剂 和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0037] 下述说明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0038] 下述说明中的比例，如无特别说明，均为体积比例。
[0039] 1.拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽的亲和淘选与鉴定
[0040] 1. 1亲和淘选
[0041] 用包被液（pH8. 6,0?lmol/L的NaHC03溶液）分别将纯化后的带有His标签分子 的重组OmpU蛋白（即rOmpU蛋白）和His标签蛋白（均为本实验室通过基因工程技术表 达和纯化后获得）稀释为100yg/mL，包被酶标板，每种蛋白重复4孔，100yL/孔，置4°C过 夜；次日弃包被液，每孔加200yL的5%BSA(牛血清白蛋白），37°C封闭lh;倒掉封闭液， 用TBST溶液（TBS+0. 5%Tween-20)洗涤6次。用TBST稀释噬菌体随机十二肽库（购自美 国NEB公司）至1. 0X1013PFU/mL，取稀释后的肽库液100yL加到包被有His标签蛋白的 酶标板孔内，重复4孔，室温振荡60min，吸出孔内未与His标签蛋白结合的噬菌体液体作为 预筛选液。用His标签蛋白预筛选的目的是排除rOmpU蛋白