一种六肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药与化妆品等领域，具体涉及一种合成六肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 生物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫调节、抗 菌、降血压、抗癌、抗氧化等作用，从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类，由25个天然 氨基酸通过肽键以不同组成和排列方式构成。活性肽安全性极高，是当前国际食品界最热 门的研究课题和极具发展前景的功能因子。现代营养学表明，蛋白质经消化道酶作用后并 不完全以游离氨基酸的形式吸收，大多以低肽的形式吸收，并且低肽比游离氨基酸具有更 高的营养价值和生物效价。
[0003] 自二十世纪中叶以来，随着人们生活水平的提高以及细胞生物学、分子生物学等 学科的飞速发展，科学家们对于衰老机制的探索取得了长足的进步，其中广泛研究的理论 有自由基-氧化应激学说，炎性学说，免疫学说，线粒体DNA学说等，其中，自由基-氧化应 激学说最受重视，并能与其他学说联系起来，起到纽带作用。该学说的发展始于Harman于 1956年提出，他认为自由基才是真正引发的机体老化的罪魁祸首，也是引起机体组织恶性 增生等各种恶性疾病的关键所在。1990年，美国Sohal教授发展了该学说，率先提出了氧化 应激的概念，并在自由基学说的基础上发展形成了 "自由基-氧化应激学说"。具体而言， 正常的机体自身建立并形成一套完善的防御系统以规避自由基的损伤和破坏，如细胞内存 在的各种抗氧化物酶，如SuperoxideDismutase,SOD;GlutathionePeroxidase,GSH-Px 等，机体清除氧自由基的能力与其活性的高低直接相关。一旦机体因内因或外因导致自由 基增加过量从而无法及时清除时，由于自由基都带有不成对的单电子，可以攻击体内细胞， 会氧化生物膜不饱和脂肪酸、诱导蛋白质交联变性、甚至损伤细胞核及线粒体DNA或RNA 等，从而损伤细胞和组织，最终导致机体功能的缺失和老化相关疾病的发生。因此，清除体 内过量的自由基在预防某些疾病的过程中具有重要作用。
[0004] 样品清除自由基的能力是评价其抗氧化活性最常见的方法。ABTS，2, 2_联氣-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐，是一种水溶性物质，可被Mn02氧化为比较稳定的 蓝绿色ABTS自由基，此自由基在736nm有稳定的最大吸收峰，抗氧化剂能够提供氢原 子将自由基还原为无色ABTS，可根据溶液在736nm处的吸光度变化来评估抗氧化剂清 除ABTS+的能力。DPPH(1，1_二苯基-2-苦肼基）是一种醇溶性物质，在醇溶液中生成以 氮原子为中心的稳定自由基、并呈深紫色，该自由基在522nm处有最大吸收峰，加入抗 氧化样品后，溶液会褪色，可以通过其吸光值的变化来检测样品的抗氧化活性。FRAP方法 (FerricreducingantioxidantpotentialAssay)是测定物质抗氧化能力的一种方法。 原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+_TPTZ)产生蓝色 的Fe2+-TPTZ，随后在596nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。以 上三种模型由于操作简便、快捷、可控性好，因此得到广泛应用。
[0005] 构建细胞氧化损伤模型是评价样品是否具有抗氧化能力的常用方法，而红细胞由 于来源丰富、取材方便，是体外生物实验中的常用材料。自由基首先攻击红细胞膜上的脂 质和蛋白质，使细胞膜破损，释放出红细胞中的血红蛋白，称为红细胞溶血。AAPH、H202和 Hemin为常用的诱导红细胞溶血的物质。样品清除体系中存在的自由基从而抑制红细胞溶 血。原子力显微镜（AFM)是一种高分辨率的新型成像工具，在生物医学界已被广泛用于细 胞形貌及其超微结构的表征，其原理是通过检测探针扫描样品时所产生的原子间相互作用 力来获得样品形貌结构信息，经计算机软件处理成像。自由基攻击细胞膜使之结构和功能 丧失，发生细胞溶血。这一结论通过用原子力显微镜（AFM)观察对照组、损伤组和保护组红 细胞形貌得到进一步验证。
[0006] 皮肤老化主要是人的遗传倾向性（也称为年代老化）和人对环境应激的生理反应 (也称为光老化）的结果。光老化是外界环境对皮肤的生物学应答的效果，是可被广泛应 用的老化实验模型。皮肤对光老化的应答通常与正常的水合作用的缺乏、皮肤下垂以及线 条和皱纹外观有关。UVB照射可使成纤维细胞内活性氧（reactiveoxygenspecies，R0S) 堆积，超过了其清除能力，打破氧化与抗氧化平衡，发生氧化应激反应，调节一系列程序化 的细胞反应，甚至调控衰老相关的信号通路，促进细胞衰老的发生。有研究表明R0S在细胞 内的堆积是皮肤光老化发生发展过程中的重要环节。人皮肤成纤维细胞是人皮肤产胶原蛋 白的主要场所，其数量的多少和细胞胶原蛋白的产率与皮肤衰老状态息息相关。因此，人皮 肤成纤维细胞的存活率和胶原蛋白的产率是被广泛认可的评价皮肤衰老状态的指标。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种具有体外抗氧化活性、保护红细胞溶血以及促进人皮肤 成纤维细胞的增殖和胶原蛋白产生的合成六肽，可应用于生物制药与化妆品等领域。
[0008] 本发明的合成六肽缩写为GMCCSR，分子量654. 0，序列为： Gly-Met-Cys-Cys-Ser-Arg。其中， Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基； Met表示英文名称为Methionine，中文名称为甲硫氨酸的氨基酸的相应残基； Cys表示英文名称为Cysteine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸的相应残基； Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基； Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基。
[0009] 本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合 成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这 个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即 可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产 物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
[0010] 本发明将浓度为1-100Kg/mL的所述六肽与红细胞混合，在终浓度为100mM的 AAPH的作用下，孵育2h后，使得红细胞溶血率降低，其形貌比单纯AAPH处理组光滑，有序， 呈现饼状结构。所述细胞溶血抑制率达91. 80 ±1.34%。
[0011] 进一步地，所述六肽浓度为5呢/mL，所述六肽使红细胞S0D活性由2. 5976 mgprot/mL上升到 6. 4819mgprot/mL〇
[0012] 进一步地，在UVB的作用下，将所述六肽与人皮肤成纤维细胞混合，孵育72h后， 使得细胞存活率提高7. 5%-19. 1% ;同时，胶原蛋白得率提高3. 27%-16. 53%，所述六肽的浓 度为 1-10Pg/mL。
[0013] 进一步实施地，本发明将所述合成六肽与正常人血红细胞混匀，孵育，经AAPH损 伤2h后，使得细胞溶血抑制率达到91. 80 ±1.34%，用100吨/mL的合成六肽处理后的与 仅用AAPH损伤的红细胞组相比，其形貌比单纯AAPH处理组光滑，有序，呈现饼状结构。用 5Pg/mL合成六肽处理后，细胞内S0D活力由2.5976mgprot/ml上升到6.4819mgprot/ ml，结果表明，合成六肽处理后红细胞的SOD活性有较大提高，可在生物医药与化妆品制备 等领域应用。
[0014] 进一步实施地，本发明在UVB(80mJ/cm2)的作用下，将浓度为1-10 吨/mL的合成六 肽加入人皮肤成纤维细胞培养液中孵育，孵育72h后，使得细胞存活率提高7. 5%-19. 1% ; 同时，胶原蛋白得率提高3. 27%-16. 53%。胶原蛋白得率由模型组的11. 9512±1. 2067吨/ mL上升为合成六肽组的13. 9268 ±1.3409Pg/mL。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有如下优