[0050] 图10为本发明实施例2的不同氨基酸底物对谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯 修饰的香豆素6纳米粒（C6 SPG25 PLGA NPs)与Hela细胞膜上中性大氨基酸转运体1(LAT1) 低温结合的影响。
[0051] 图11为本发明实施例2的钠离子对谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香 豆素6纳米粒（C6 SPG25 PLGA NPs)摄取的影响；
[0052] M Na+含钠离子的缓冲液；HI Na+free不含钠离子的缓冲液。
[0053] 图12为本发明实施例2的不同氨基酸底物对谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯 修饰的香豆素6纳米粒（C6 SPGffi PLGA NPs)和聚乙二醇单硬脂酸酯香豆素6纳米粒（C6 SPn PLGA NPs)与Hela细胞膜上中性大氨基酸转运体1(LAT1)摄取的影响；
[0054] SP :SP修饰的香豆素6PLGA纳米粒；SPG :SPG修饰的香豆素6PLGA纳米粒
[0055] 图13为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳 米粒（C6 SPG25 PLGA NPs)的摄取机制。
[0056] 图14为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳 米粒（C6 SPG25 PLGA NPs)对Hela细胞膜上中性大氨基酸转运体1(LAT1)的活性调控。
[0057] 图15为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的紫杉醇纳米 粒（PTX SPG25 PLGA NPs)和聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的紫杉醇纳米粒（PTX SPn PLGA NPs) 对肿瘤体积生长的影响。
[0058] --鲁-:Saline生理盐水组；.、、、?、、、. Taxol 紫杉醇溶液剂组；如.SPG25 PTX NPs 10% SPG25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒组；'.V SP25 PTX NPs 10% SP25修饰的紫杉醇PLGA纳 米粒组。
【具体实施方式】
[0059] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施 例范围之中。
[0060] 实施例1
[0061] 四种不同PEG链长谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯的制备。
[0062] N-苄氧羰基-L-谷氨酸-1-苄酯（Z-Glu-OBzl，II)，溶于适量二氯甲烷、二甲基亚 砜等有机良溶剂中，在催化剂的作用下，如：1- (3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐（EDC)和4-二甲氨基吡啶（DMAP)，避光冰浴lh-2h，然后与不同链长聚乙二醇单硬脂酸 酯（SPn，I )在30°CN2保护下反应12h-48h，经分离纯化得到淡黄色固体的III。III化合物 经过钯碳还原反应，脱掉谷氨酸的保护基团，再经过进一步分离纯化得到最终化合物-谷 氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯（SPGn，IV )。反应式如下：
[0064] 步骤中η为10~40。即聚乙二醇的分子量为500, 1000和2000,但是并不限于此， 本发明的聚乙二醇亦可是一端为羟基修饰的聚乙二醇，但是并不局限于以上三种物质。聚 乙二醇的分子量可以为500-5000范围内。
[0065] 采用核磁共振测定1H-NMR氢谱来确定实施例1中靶向材料的结构，选用的溶剂 为d-DMSO,结果如图1。2. 3ppm，L 8ppm和4. 2ppm分别为谷氨酸上-CH2-和-CH-上的H， 3. 52-3. 75ppm间的质子峰为PEG中的H。0· 8ppm为单硬脂酸酯的-CH3-的特征峰。1. 2ppm 为单硬脂酸酯的-ch2-的特征峰。
[0066] 实施例2
[0067] 乳化溶剂挥发法制备载紫杉醇或香豆素6的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的 纳米粒
[0068] 称取lmg紫杉醇或香豆素6,溶于lmL二氯甲烷中，加入lmg或2mg实施例1制备 的不同PEG链长的谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯或聚乙二醇单硬脂酸酯，以及20mg的 聚乳酸聚羟基乙酸共聚物。加至5mL 1%聚乙烯醇水溶液中，探头超声300W，10min，搅拌过 夜，3500rpm离心10min，除去未包裹的药物。
[0069] 将实施例2中制备的纳米粒通过动态光散射和透视电镜测定胶束的粒径大小和 形态，结果如图4。动态光散射测定不同配体密度和PEG链长的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸 酯修饰的纳米粒，纳米粒的粒径范围在151. 7-180. 6nm，粒径分布窄；透视电镜图表明载药 胶束为粒径均一的球形。
[0070] 表1不同PEG链长和靶向材料密度对于Hela细胞的IC5。值。
[0072] 实施例3
[0073] 谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒在血浆中的稳定性试验
[0074] 按照实例2制备谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒，将纳米 粒置于含有10% FBS的pH 7. 4磷酸盐缓冲液中，通过动态光散射测定各纳米粒在 Oh, lh, 2h, 4h, 6h 8h, 10h, 12h 和 24h 的粒径。
[0075] 图5结果表明不同配体修饰密度和PEG链长的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰 的载药纳米粒具有较好的血浆稳定性。
[0076] 实施例4
[0077] 谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒体外释放试验
[0078] 采用透析法考察实例2制备谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒的 体外释药特征。移取200 μ g的载药胶束溶液于透析袋中，透析袋两端夹紧，分别置于含有 30mL pH 7. 4PBS(含2%Cremophore EL)的释放介质的锥形瓶中，在37°C恒温振荡器中以 100r/min进行体外释放度考察。分别在0. 5、l、2、4、6、8、10、12、24h取样2mL，同时将透析 袋取出并放入新鲜的30mL释放介质中，样品经0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取20 μ L进行HPLC 测定。
[0079] 图6结果表明谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒释药缓慢，并且随 着PEG链长的增加，释药速度下降；随着靶向材料修饰密度的增加，释药速度也随之下降。 不同链长的PEG对纳米粒的修饰能够在纳米粒表层形成不同状态的保护，PEG链延长和修 饰密度的增加所形成的水化层均有利于延缓药物的释放。
[0080] 实施例5
[0081] 细胞毒性实验
[0082] 将处于对数生长期的人宫颈癌细胞（Hela)以5 X 104/孔/0. lmL的1640培养液埋 于96孔板中，24h后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒以 不同浓度分别加入各孔，每孔加入100 μ L含纳米粒溶液，每个浓度3个平行孔，置培养箱中 孵育。培养48h和72h后，取出96孔板，每孔加入20 μ L的5mg/mL ΜΤΤ，培养箱中孵育4h， 甩板，将96孔板倒扣于滤纸中充分吸干残留液体，每孔加入150 μ L DMS0于振荡器中振荡 lOmin，酶标仪测定各孔492nm处的吸光度。计算抑制率：
[0083] 抑制率（％ ) = (1-A加药孔/A对照孔）X 100 %
[0084] MTT法测定载有紫杉醇纳米粒细胞毒性结果如图7,不同浓度载药纳米粒作用于 Hela细胞株48h和72h后，细胞抑制率随药物浓度和孵化时间增加而增大，并且对细胞的抑 制作用随着靶向材料密度的增加而增强。
[0085] 实施例6
[0086] 细胞摄取实验
[0087] 将LAT1高表达的Hela细胞和LAT1低表达的NIH3T3细胞以2X 105/孔/0. lmL 的1640培养液和DMEM培养液埋于96孔板中，24h后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇 单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒或聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒，由HBSS 缓冲液稀释相同的香豆素6的浓度加入各孔中，每孔100 μ L，平行3孔，置培养箱中孵育lh 和3h。弃上清，每孔加入50 μ 1 0. 5% TrtionX-100 (含0. 2N NaOH)的PBS溶液并置摇床 中作用lh。随后，在激发波长为458nm，发射波长为525nm测定细胞内荧光强度，并对每孔 进行蛋白含量测定，并计算摄取量。
[0088] 细胞摄取的结果见图8,图9,在LAT1高表达瘤株中，谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸 酯修饰的香豆素6纳米粒的细胞摄取量均比聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒 高，并且随着靶向材料修饰密度的增加，细胞摄取增加。而在LAT1低表达瘤株中，这两种纳 米粒细胞摄取未体现出这样的趋势。
[0089] 实施例7
[0090] 不同氨基酸底物对谷氨酸修饰的纳米粒（C6 SPG25PLGA NPs)与LAT1结合的影响 实验
[0091] 将LAT1高表达的Hela细胞细胞以2 X 105/孔/0. lmL的1640培养液和埋于96孔 板中，24h后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒， 由HBSS缓冲液稀释致相同的香豆素6的浓度，并与不同氨基酸混合均匀后，加入各孔中，每 孔100yL，平行3孔，置4°C中孵育3h。弃上清，每孔加入50μ1 0. 5%TrtionX-100 (含 0. 2N