位 点。当该单碱基错配祀位点与sgRNA结合时，就会在该位点上形成一个碱基错配。对每个 位点而言，可获得三种错配模式的单碱基错配靶位点，这些单碱基错配靶位点的集合即是 本发明所述的单碱基错配靶位点序列文库。通过研究所述sgRNA对单碱基错配靶位点的切 割效率，我们完成了本发明。
[0015] 首先，本发明提供了一种DNA文库，该文库包括针对一个SgRNA分子种子区的单碱 基错配靶位点片段。为了系统地研究sgRNA分子的脱靶效应，优选情况下该DNA文库包括 针对一个sgRNA分子的目的DNA识别序列或全长序列的单碱基错配靶位点序列。
[0016] 本发明进一步提供了上述DNA文库与报告基因载体连接的DNA载体文库。优选情 况下，该报告基因载体为可激活的报告基因载体。可激活的报告基因载体是指该载体中的 报告基因在本底水平是不表达的，只有在sgRNA识别了报告基因上游的靶位点并对靶位点 产生了切割，报告基因才会表达。所述报告基因优选为萤火虫荧光素酶（luciferase)报告 基因或荧光蛋白基因。在研究单碱基错配对sgRNA对错配靶位点的切割效率的影响时，仅 需对单个位点进行错配碱基替换；而如需研究多碱基错配对sgRNA对错配靶位点的切割效 率的影响时，则需同时对多个位点进行错配碱基替换。而在多碱基错配时，则有多种错配碱 基替换组合。
[0017] DNA载体文库的构建流程为：
[0018] (1)获得一个SgRNA分子序列；
[0019] (2)获得上述单碱基错配的靶位点序列片段；
[0020] (3)将与所述sgRNA分子完全匹配的靶位点序列片段、以及步骤（2)中获得的与所
[0021] 述sgRNA序列存在单碱基错配的靶位点序列片段，连接到报告基因载体中。
[0022] 更进一步地，本发明还提供了上述DNA文库或载体文库用于检测sgRNA脱靶效应 的方法，包括如下步骤：
[0023] (1)获得sgRNA或sgRNA表达载体；
[0024] (2)获得上述sgRNA单碱基错配靶位点DNA文库或载体文库；
[0025] (3)将步骤⑴中获得的sgRNA或sgRNA表达载体、步骤⑵中获得的单碱基错配 靶位点文库、表达核酸酶cas9的载体或核酸酶cas9转入细胞中；
[0026] (4)检测sgRNA对单碱基错配靶位点的切割。
[0027] 再进一步地，本发明提供了一种试剂盒，包括上述DNA文库或DNA载体文库。优选 情况下，该试剂盒还包括sgRNA或sgRNA表达载体，核酸酶cas9或其表达载体。
[0028] 最后，本发明还提供了上述DNA文库或DNA载体文库用于Cas9蛋白序列优化的用 途。
[0029] 本发明的有益效果
[0030] 本发明提供了一种用于研究sgRNA脱靶效应的单碱基错配靶位点DNA文库、单碱 基错配靶位点DNA载体文库、以及利用这些文库评价sgRNA脱靶效应的方法。利用这些文 库，能够更精确和全面地评价sgRNA的脱靶效应。
【附图说明】
[0031] 图1 sgRNA脱靶作用检测技术流程图。
[0032] 图2利用单碱基错配靶位点文库评价sgRNA-Ι的脱靶效应。按照碱基错配位点和 碱基错配类型，我们将sgRNA对其碱基错配靶位点的切割活性进行排列。将PAM序列上游 的第一个碱基位置定义为（+1)位，其他靶位点序列按sgRNA互补链的Y -3 ^方向顺序编 排，PAM序列位置被依次定义为-1、-2和-3位。水平轴为靶位点序列编号；纵轴为sgRNA 的切割活性，以对完全匹配靶位点的切割活性为100%，以此作为参照计算对碱基错配位点 的切割活性。对每个碱基位点而言，碱基错配靶位点的排列顺序从左至右依次为A、G、T、C， 白色填充的柱子表示与sgRNA完全匹配的靶位点。
[0033] 图3利用单碱基错配靶位点文库评价sgRNA-2的脱靶效应。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0035] 实施例一、sgRNA脱靶作用检测系统及sgRNA单碱基错配靶位点文库构建
[0036] 本发明所使用的sgRNA脱靶作用检测系统为百奥迈科生物技术有限公司（http : //www. biomics. com)提供的 pSG-target Cloning Kit&Single Stranded Annealing Assay(BV3100)系统。该系统包含3个质粒：pCas质粒编码cas9蛋白，psgRNA质粒编码 sgRNA序列，pTarget质粒编码一个无活性的萤火虫焚光素酶（firefly luciferase)报告 基因。在无活性状态，萤火虫荧光素酶报告基因被分成两个部分，中间间隔一个终止密码 子、一个sgRNA的革E1位点、以及两段1〇〇〇个碱基长度的同向重复序列。当sgRNA/Cas9复合 体作用于sgRNA的靶位点，产生一个双链切割时，细胞内的DNA修复系统会在切割位点两侧 同向重复序列的基础上，通过同源重组，将断裂片段连接成一个有活性的萤火虫荧光素酶 报告基因。该过程如图1所示。
[0037] 利用萤火虫荧光素酶报告基因检测系统，我们分别检测未经sgRNA处理的无活 性萤火虫荧光素酶报告基因、以及经过sgRNA处理的报告基因的活性，以无活性萤火虫荧 光素酶报告基因的检测值为参照，分析经sgRNA处理后报告基因活性的增加量，就能计算 sgRNA对靶位点的切割能力。
[0038] 单碱基错配靶位点文库构建流程：试剂盒中提供的sgRNA表达载体和sgRNA靶位 点表达载体均为线性化的质粒DNA。按照试剂盒说明书的要求，根据所研究sgRNA的序列、 以及其完全匹配和单碱基错配靶位点序列，设计并合成相应的插入片段，进行DNA克隆操 作。本发明所使用的DNA寡聚核酸由Invitrogen北京分公司合成。实验步骤具体如下：
[0039] 质粒构建实验步骤：
[0040] 1、T4：DNALigase 连接
[0041] 将合成的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA，再与线性化的载体连接。
[0042] 退火反应体系如下：
[0043] 正链 Oligo (100 μ M) 2 μ 1
[0044] 负链 Oligo (100 μ Μ) 2 μ 1
[0045] ddH20 加至 20 μ 1
[0046] 将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中，反应条件为：(95°C- 90°C -…一25°C ) (每个温度维持3min) - 10°C。保存在_20°C冰箱。取2μ1的双链DNA进行T4DNA Ligase 连接反应，反应体系如下：
[0048] 将以上体系瞬时离心后，16°C孵育16小时后，于_20°C保存。
[0049] 2、转化大肠杆菌感受态细胞
[0050] 取ToplO感受态细胞置于冰浴中，30min后向感受态细胞悬液中加入连接产物 (50μ1感受态细胞中加入5μ1连接产物），轻弹混匀，在冰浴中静置30min。将离心管 置于42°C水浴中放置60-90sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷去2-3min。向离 心管中加入350 μ 1无菌的2XYT培养基（不含抗生素），混匀后置于37°C摇床振荡培养 45min(150rpm)，使菌体复苏。将离心管内容物混匀，吸取200 μ 1已转化的感受态细胞加到 含相应抗生素（sgRNA表达载体为氨苄抗性，sgRNA靶位点表达质粒为卡那霉素抗性）的LB 固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻地将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体 被吸收，倒置平板，37°C培养16h。
[0051] 3、阳性克隆的鉴定
[0052] (1)