测定人NEFM基因rs12515位点多态性的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及测定单核苷酸多态性的方法。
【背景技术】
[0002] SNP (单核苷酸多态性）是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基 的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生倶来的遗传特征，不随环境发生变化， 也不是某种疾病特异或者非特异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。
[0003] 基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如下：1.研究物种起 源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获得生物大分子的信息，推断生物进化历史， 阐明物种进化关系。应用于考古学中以确定古人类遗传变异特征以及不同种群的亲缘关 系。2.研究多态与种群未缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切相关，包括身 高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可以用于疾病预防措施。通过研究人体 对毒物的耐受性，发现易于对某种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触， 保护该易感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，筛查出容易出 现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有机溶剂，保护此类易感人群免受毒物 侵害。4.药理学中可以用于药物选择以及剂量确定。通过多态检测可以判断患病个体对某 种药物毒副作用敏感，从而避免使用此种药物以免除其毒性作用。通过判断个体对药物效 果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。
[0004] 神经纤维丝（Neurofilaments, NFS)是真核生物细胞中主要的细胞骨架元素，主 要存在于神经元中。其按分子量不同可分为三种亚单元，即分子量为68kd的低分子量 神经纤维丝（Neurofilment, light polypeptide, NEFL)，150kd大小的中等大小分子量 神经纤维丝（Neurofilament, medium polypeptide, NEFM),和 200kd 的高分子量神经丝 (Neurofilament, heavy polypeptid, NEFH)。每种亚单元都是单个基因产物，在细胞骨架中 起到重要的作用。
[0005] 中分子量神经纤维丝基因又称为神经纤维丝中链基因，是近年来研究较多的一种 细胞骨架基因，定位于染色体8p21，有4个外显子。有研究表明NEFM基因多态性可能与其 编码的蛋白功能有关。NEFM基因 rsl2515位点位于UTR-3区域，有研究表明该多态可能影 响NEFM的功能。
[0006] NEFM基因 rsl2515位点多态，在人群中存在两种等位基因 C和T，形成三种NEFM 基因的基因型：CC型（人体基因组rsl2515多态位点的两个等位基因碱基均为C)，CT型 (人体基因组rs12515多态位点的两个等位基因碱基分别为C和T)和TT型（人体基因组 rsl2515多态位点的两个等位基因碱基均为T)。
[0007] 聚合酶链式反应-限制性片断长度多态（PCR - RFLP)技术是一种快速、简便、准 确、低成本测定SNP(单核苷酸多态性）基因型的经典方法。该方法通过引物来对模板进 行扩增反应，形成足够数量和稳定的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的 片段长度，最终测定出SNP。目前为止，尚未发现有限制性内切酶可以识别含NEFM基因 rsl2515多态位点的碱基序列，不能采取PCR - RFLP技术进行检测。因此需要开发新的检 测技术。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人NEFM基因 rsl2515 位点多态性的可靠手段。
[0009] 根据本发明的第一方面，提供了一种测定人NEFM基因 rsl2515位点多态性的方 法，包括：
[0010] 提供待测人基因组DNA ;
[0011] 提供扩增人NEFM基因 rsl2515位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引 物具有错配喊基G ;
[0012] 以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以 获得含GTAAAY片段，其中Y为人NEFM基因 rsl2515位点上的待定碱基C或T ;
[0013] 提供限制性内切酶；
[0014] 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切（反应）以获得相应的酶切产物；以 及
[0015] 根据所得酶切产物来确定人NEFM基因 rsl2515位点上的待定碱基Y是C还是T， 其中，限制性内切酶为仅能够切开GTAAAC片段与GTAAAT片段之一的限制性内切酶。
[0016] 根据本发明的实施例，在所得扩增产物上，上游引物的错配碱基G与Y之间相隔四 个碱基TAAA。令人惊讶的是，如此设置错配碱基将使酶切反应进行得极其顺利，不会出现酶 切不充分等现象。并且，如此设置上游引物错配碱基使PCR反应进行顺利，提高了 PCR的灵 敏度和特异度，这可能与错配碱基后使得扩增序列的二级结构改变有关。
[0017] 在本发明的一个可选实施例中，在所得扩增产物上，上游引物末端碱基与Y相邻。
[0018] 在本发明的一个优选实施例中，在所得扩增产物上，上游引物末端碱基不与Y相 邻。例如，上游引物末端可以是……GTAA、……GTA、……GT结构。难以想象，具有这种设 计的上游引物竟然会进一步大大促进酶切反应，这可能与扩增结合力有某种关联。
[0019] 在本发明的一个优选实施例中，限制性内切酶可以采用仅能切开GTAAAC片段的 Hpyl66II或其同裂酶。这类酶价格低廉，能大大降低测定成本。
[0020] 根据本发明的实施例，所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长度的未切 断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产物（较短 片段通常不能有效观测到）。通过观测（判断）酶切产物所包含的片段类型来确定人NEFM 基因 rsl2515位点上的待定碱基是C还是T。例如，在采用Hpyl66II酶的情况下，根据总片 段和切断后较长片段这两个片段的观察结果来进行判断：如果观察到酶切产物只有一种具 有总片段长度的未切断扩增产物，则待定碱基为T ;如果观察到酶切产物只有一种具有较 长片段（小于总片段长度）的切断产物，则待定碱基为C;如果观察到上述二者，则待定碱 基既包括C又包括T。
[0021] 在本发明的一个实施例中，判断（或观测）酶切产物所包含的片段类型是通过凝 胶电泳联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。这种情况下，优选参照图是扩增产物在 凝胶电泳标准设定时间后经紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图 像位置，其中第一参照图像位置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图 像位置则针对的是切断后具有较长片段的扩增产物。例如，本发明采用的参照图是由合成 的119bp和82bp两个碱基片段同时经凝胶电泳相同时间后紫外灯拍照而成。与常规DNA ladder的复合参照图相比，由于采用了仅具有两个特定参照图像位置的参照图，本发明的 这种方法能够直观快速地观测或判断酶切产物所包含的片段类型，同时最大限度地避免了 误判。酶切反应后优选将酶切产物浓缩1~2倍浓度后进行电泳，增加图像亮度，提高判断 准确性。
[0022] 在本发明的优选实施例中，通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增产物 的总片段长度在100至300bp之间，并且上游引物的片段长度至少为35bp，优选长度40~ 60bp (在该优选区间扩增反应尤其顺利充分），使得酶切切掉部分片段长度占总片段长度 的百分比超过20%。本发明的这种设计可以使得具有总片段长度的未切断扩增产物与切断 后具有较长片段的扩增产物的电泳紫外照片的位置区别显著。但是，如果总片段过长，则电 泳位移将不明显；过短则图像会变得模糊一片，无法准确区分。上游引物的片段长度范围保 证了 PCR扩增反应能够顺利进行，避免了错配碱基时会出现的扩增不足现象。
[0023] 在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中退火温度的范围在55~70°C 之间，优选温度60~69°C (该温度可提高扩增反应的