一种miRNA标志物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学分子生物学技术领域，具体地，涉及一种miRNA标志物及其特异 性引物与应用。
【背景技术】
[0002] microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约19-24个核苷酸的小RNA，具有多种重 要的生物调节作用。miRNA在体液中可有多种存在形式：与高密度脂蛋白胆固醇（HDL)、 低密度脂蛋白胆固醇（LDL)、脂蛋白（a) (Lp(a))等结合，也可被选择性包裹在外吐小体 (exosome)和微囊泡（microvesicle)等膜性结构中分泌至细胞外。越来越多的研究表明， 体液miRNA，特别是外周血miRNA对疾病的诊断和治疗监测具有较大的潜在价值。然而，对 于阿尔兹海默病，利用miRNA标志物来辅助诊断仍有待进一步研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种有利于有效提高诊断阿尔兹海默 病的准确性的miRNA标志物及其特异性引物以及它们的应用。
[0004] 本发明的发明人在研究过程中利用超速离心法分离血浆、血清、脑脊液和培养基 中的外吐小体，测定其中miRNA-135a和miRNA-193b水平，发现外吐小体中miRNA-135a 和miRNA-193b检测对辅助诊断阿尔茨海默病（AD)具有一定的价值。因此，为了实现上 述目的，第一方面，本发明提供了一种miRNA标志物，该miRNA标志物包括miRNA-135a和 miRNA-193b〇
[0005] 第二方面，本发明提供了第一方面所述的miRNA标志物在制备用于诊断阿尔兹海 默病的试剂盒中的应用。
[0006] 第三方面，本发明提供了针对miRNA-135a和miRNA-193b的特异性引物在制备用 于诊断阿尔兹海默病的试剂盒中的应用。
[0007] 第四方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有引物、逆转录酶、缓冲液、 dNTPs、RNase抑制剂和荧光染料，其中，所述引物包括针对miRNA-135a和miRNA-193b的特 异性引物。
[0008] 通过上述技术方案，本发明能够准确有效地诊断阿尔茨海默病，提高了疾病诊断 的敏感性和特异性。
[0009] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0010] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0011] 图1是患者与健康对照的外吐小体内miR-135a和miR-193b水平的统计学分析结 果。
【具体实施方式】
[0012] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0013] 本发明提供的miRNA标志物包括miRNA-135a和miRNA-193b (优选为miRNA-135a 和miRNA-193b)。其中，miRNA-135a和miRNA-193b的核苷酸序列为本领域技术人员所熟 知，例如，miRNA-135a的核苷酸序列可以如SEQ ID N0 :1所示。miRNA-193b的核苷酸序列 可以如SEQ ID N0 :2所示。
[0014] SEQ ID N0：1 ：UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA
[0015] SEQ ID NO ：2 ：CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA
[0016] 本发明还提供了上述miRNA标志物在制备用于诊断阿尔兹海默病的试剂盒中的 应用以及针对miRNA-135a和miRNA-193b的特异性引物在制备用于诊断阿尔兹海默病的试 剂盒中的应用。
[0017] 其中，针对miRNA-135a和miRNA-193b的特异性引物可以为常规的引物，优选情况 下，所述引物包括：上游引物如SEQ ID N0 :3所示且下游引物如SEQ ID N0 :4所示的第一 引物以及上游引物如SEQ ID N0 :5所示且下游引物如SEQ ID N0 :4所示的第二引物。
[0018] SEQ ID NO ：3 ：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCACATAGGA
[0019] SEQ ID NO ：4 ：ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA
[0020] SEQ ID NO ：5 ：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATCTCGCC
[0021] 本发明提供的试剂盒含有引物、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂和荧光染 料，其特征在于，所述引物包括针对miRNA-135a和miRNA-193b的特异性引物。其中，对所 述引物的选择如前所述，在此不再详述。
[0022] 本发明的试剂盒可以有效定量检测miRNA-135a和miRNA-193b，从而辅助诊断阿 尔茨海默病，敏感性和特异性较高。
[0023] 根据本发明，所述逆转录酶、缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂和荧光染料均为常规用 于定量检测miRNA的试剂，本领域技术人员能够对其进行选择。
[0024] 根据本发明，所述试剂盒还含有从外吐小体中提取miRNA的试剂。从外吐小体中 提取miRNA的试剂可以包括：亲和柱法提取用试剂（含有裂解液、吸附柱和洗脱液，具体可 参见TIANGEN公司的DP501试剂盒）。
[0025] 根据本发明，所述试剂盒还可以含有用于从试样中获得外吐小体所使用的缓冲液 (如磷酸盐缓冲液，PBS)。
[0026] 在本发明的一种实施方式中，涉及一种诊断阿尔兹海默病的方法，其包括：从 待测试样（可以为血清或血浆）中获得外吐小体；从外吐小体中提取miRNA;定量检测 miRNA-135a和miRNA-193b。如果检测的miRNA-135a和/或miRNA-193b与对照试样具有 显著差异，则待测试样对应的个体患有阿尔兹海默病。
[0027] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0028] 实施例1
[0029] (1)临床资料
[0030] 随机选取存在认知障碍的受试者共329例。其中轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI)131名（男65例，女66例，平均年龄58. 3±6· 7岁），痴呆期AD患者 ((^1116111:丨&〇€八12116；[11161'七7口6,0厶1')198例（男99例，女99例，平均年龄67.2±8.6岁） 。疾病诊断符合美国国立卫生研究院国立老化研究所和阿尔茨海默病协会于2011年4月联 合发布的AD诊断标准。另选取性别年龄匹配的健康受试者为健康对照。
[0031] (2)标本留取
[0032] 受试者空腹12小时后于上午分别使用促凝采血管和肝素采血管空腹抽取静脉 血，1小时内分离血清和血浆。标本于分析前保存在_80°C冰箱内。
[0033] (