3)外吐小体的提取
[0034] 使用已建立方法提取血清和血衆中的外吐小体（参见Th6ry C, Ami gorena S, Raposo G, et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[M]. Curr Protoc Cell Biol, 2006, Chapter 3:Unit 3. 22以及赵明芳，曲品嘉，曲秀娟，等.胃癌细胞来源的exosome的提取和鉴 定[J].中国医科大学学报，2008, 37(4) :500-1转504):将从-80°C冰箱取出的标本置于 4°C冰箱，待标本完全复融后立即转入玻璃试管。使用PBS将标本按照1:1稀释，4°C 2000g 离心30min ;小心地将上清转移至超速离心管中，避免混入沉淀以防止细胞碎片污染； 4°C 12000g离心45min ;小心吸出上清，4°C 110000g离心2h ;弃上清，加入5ml PBS充分混 匀；使用0. 22 μπι滤器过滤混合液；4°C 110000g离心70min ;弃上清，加入5mL PBS混匀后 4°C 110000g离心70min ;弃上清，加入100 μ L重悬沉淀，即为外吐小体混合液。
[0035] (4)小 RNA 提取及 miRNA-135a 和 miRNA-193b 测定
[0036] 使用TIANGEN公司miRcute miRNA亲和柱法试剂盒进行小RNA提取，每100 μ L 外吐小体PBS溶液加入100 μ L裂解液，后续步骤按照说明书进行，纯化好的小RNA溶 解于 10yL RNase-Free dd H20 中。10yL 逆转录体系中含 RNA 模板 0.2ng，RT Primer Mix 2yL，5XRT Buffer 2yL，RNase inhibitor lyL，dNTP(2.5mM)lyL，逆转录酶 lyL。25yL miRNA 检测体系中含 miRNA cDNAlyL，2XSYBR Green Mix 12.5yL，相应 上下游引物（SEQIDN0:3-5)各0·5μL。反应条件：95°C5min;95°C20sec，62°C30sec， 72 °C 30sec，40个循环。使用2- Δ Δ CT法计算并统计miRNA-135a和miRNA-193b表 达的差异（参见 Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method[J]. Methods, 2001, 25(4) :402-408)。
[0037] (5)统计学分析
[0038] 按照上述方法，使用外吐小体内miR-135a和miR-193b联合检测，如果检测的 miRNA-135a和/或miRNA-193b与对照试样具有显著差异，则判定患有阿尔兹海默病。诊断 MCI的阳性符合率为78. 1 %，阴性符合率为84. 3%;诊断DAT的阳性率为82. 3%，阴性符合 率为88. 5%。同时，MCI和DAT患者的外吐小体内miR-135a和miR-193b水平与健康对照 组间均有统计学差异（见图1)。其中，阳性/阴性符合率=(检测结果为阳性/阴性的人 数+实际为阳性/阴性的人数）X 100%。
[0039] 对比例1
[0040] 按照实施例1的方法诊断AD，不同的是，仅检测miRNA-135a。结果如表1所示。
[0041] 对比例2
[0042] 按照实施例1的方法诊断AD，不同的是，仅检测miRNA-193b。结果如表1所示。
[0043] 表 1
[0045] 对比例1和对比例2与实施例1的诊断阳性符合率和阴性符合率相比具有统计学 差异，说明本发明能够准确有效地诊断阿尔茨海默病。
[0046] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0047]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0048] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种miRNA标志物，其特征在于，该miRNA标志物包括miRNA-135a和miRNA-193b。2. 根据权利要求1所述的miRNA标志物，其中，miRNA-135a的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，miRNA-193b的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3. 权利要求1或2所述的miRNA标志物在制备用于诊断阿尔兹海默病的试剂盒中的应 用。4. 针对miRNA-135a和miRNA-193b的特异性引物在制备用于诊断阿尔兹海默病的试剂 盒中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其中，所述引物包括：上游引物如SEQIDNO:3所示且 下游引物如SEQIDNO:4所示的第一引物以及上游引物如SEQIDNO:5所示且下游引物如 SEQIDN0:4所示的第二引物。6. -种试剂盒，该试剂盒含有引物、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂和荧光染 料，其特征在于，所述引物包括针对miRNA-135a和miRNA-193b的特异性引物。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述引物包括：上游引物如SEQIDNO:3所示 且下游引物如SEQIDNO:4所示的第一引物以及上游引物如SEQIDNO:5所示且下游引物 如SEQIDNO:4所示的第二引物。8. 根据权利要求6或7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有从外吐小体中提取 miRNA的试剂。
【专利摘要】本发明涉及医学分子生物学技术领域，公开了一种miRNA标志物及其在制备用于诊断阿尔兹海默病的试剂盒中的应用，该miRNA标志物包括miRNA-135a和miRNA-193b。本发明还公开了针对miRNA-135a和miRNA-193b的特异性引物在制备用于诊断阿尔兹海默病的试剂盒中的应用。此外，本发明还公开了一种试剂盒，该试剂盒含有引物、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂和荧光染料，其中，所述引物包括针对miRNA-135a和miRNA-193b的特异性引物。本发明能够准确有效地诊断阿尔茨海默病，提高了疾病诊断的敏感性和特异性。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105316407
【申请号】CN201510673589
【发明人】刘辰庚, 张跃其, 王培昌
【申请人】首都医科大学宣武医院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年10月16日