一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属分子生物学和医学领域，涉及一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性 的mRNA联合IncRNA模型及其应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是全球发病率最高的女性恶性肿瘤，2008年全球乳腺癌新发病例138万， 占女性癌症发病总数的23% ;死亡人数高达46万，占女性癌症死亡人数的14%。在上海等大 中城市，乳腺癌也已经连续20年位于女性恶性肿瘤第一位，严重危害广大妇女健康。据上 海市疾控中心数据显示，2004年上海市区粗发病率达10万分之71。2001年Sorlie团队将 乳腺癌基于其基因表达差异划分为腔面A、B型，人表皮生长因子受体2(HER2)阳性型，正常 乳腺型和基底细胞型，该成果将乳腺癌研究推进至分子分型层面。当前已经公认乳腺癌为 一种异质性疾病，专注于某一亚型的研究才能更加准确的阐明其生物学特性，实现精准的 个体化治疗；通过免疫组化对雌激素受体（ER)，孕激素受体（PR)，HER2状态及Ki67检测， 临床上也可将乳腺癌划分腔面A、B型，HER2阳性型，三阴性乳腺癌，并与基于基因表达差异 有着高度的重合性；其中，三阴性乳腺癌为ER，PR，HER2表达全为阴性，约占所有乳腺癌的 10%-20%。相比较于其他类型乳腺癌，上述三阴性乳腺在年轻患者中更为常见，其侵袭性更 强，表现为更大的肿瘤，更高的分级，更多的淋巴结累及等。已有研究表明，三阴性乳腺癌可 进一步划分为6个亚型，每个亚型都有各自独特的表达谱差异及不同的药物敏感性。由于 三阴性乳腺癌存在着极大的异质性以及缺乏有效的治疗方法，目前其治疗依旧存在着许多 挑战。目前临床治疗中，化疗是三阴性乳腺癌唯一的全身治疗方法；尽管相比较于其他亚型 乳腺癌，三阴性乳腺癌患者接受新辅助治疗有着较高的缓解率，但是其依旧表现为更高的 局部复发率和远处转移率；即使在三阴性乳腺癌内，不同患者对于化疗的敏感性及临床预 后也存在着极大的差异；而目前缺乏有效的手段对此进行区分；因此，对于这群患者而言， 研究高度敏感，特异的预后预测生物标记物将具有重要的临床意义。
[0003] 目前，公认长链非编码RNA(lncRNA)是一类序列长度大于200nt的非编码RNA ; 已有研究证实IncRNA在基因调控及各种细胞代谢途径中起着重要的作用；而IncRNA在 乳腺癌中的作用也被广泛的关注，一些新的理论机制也被提出。有研究表明，所述IncRNA 在乳腺癌组织与配对的正常组织间有着明显的表达谱差异；通过对目标基因表达的调控， IncRNA能使得肿瘤呈现更加恶性的表型。Gupta团队发现一个IncRNA (HOTAIR)在乳腺癌 原发灶和转移灶中表达都明显升高，并且其在原发灶中的表达水平是个强有效的转移和死 亡的预测因子；另一个IncRNA (GAS5)也被证实在乳腺癌组织中特异性低表达，同时其在乳 腺癌细胞系中高表达后能抑制凋亡及增值。近年来，越来越多的研究证实了 IncRNA作为生 物标记物预测肿瘤患者预后的可行性。
[0004] 本发明人首先运用全转录组芯片技术筛选出候选的mRNA和IncRNA，首次构建了 mRNA联合IncRNA的预测模型；该模型可对三阴性乳腺癌患者其预后进行预测并划分高低 危人群，同时可预测患者对于紫杉化疗的敏感性从而减少过度治疗。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合 IncRNA模型，确定了一种能在癌组织中检测的、有较高预测准确度的三阴性乳腺癌预后及 化疗敏感性的分子标记物。
[0006] 本发明的预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合IncRNA模型，其特征 在于，所述模型包括SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA。
[0007] 本发明的另一个目的是提供所述的模型在预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性 中的应用，包括：制备采用实时定量PCR、试剂、试剂盒或芯片预测三阴性乳腺癌预后及化 疗敏感性的产品； 其中， 所述采用实时定量PCR预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的产品含有针对SEQ ID No. 1-10中一对或多对RNA特异性引物； 所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的试剂含有针对SEQ ID No. 1-10中一个或 多个RNA特异性探针核苷酸； 所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的试剂盒含有针对SEQ ID No. 1-10中一个 或多个RNA特异性探针核苷酸； 所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的芯片含有针对SEQ ID No. 1-10中一个或 多个RNA特异性探针核苷酸； 所述芯片或试剂或试剂盒通过下述方法预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性，检测癌 组织样品中SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA的表达水平，预测三阴性乳腺癌患者预后 及对化疗的敏感性。
[0008] 本发明还提供了所述的mRNA联合IncRNA模型构建与鉴定方法： (1) 提取获得的癌组织的RNA样本； (2) 纯化组织的RNA样本； (3) RNA质量控制：用NanoDrop 2000光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量； (4) 采用全传录组芯片检测所述乳腺癌与癌旁组织，进行过滤，标化处理后，去除差异 表达倍数不明显的探针，再利用生物信息学分析获得癌与癌旁组织差异表达的RNA，包括 mRNA和IncRNA ;对另组三阴性乳腺癌癌组织进行HTA2. 0芯片检测，将该结果与上述癌组织 结果组成训练集，利用单因素 C0X比例风险回归模型，计算每个差异表达RNA与患者无复发 生存的关系，筛选其中差异表达以及与疾病RFS相关的RNA (如SEQ ID No. 1-10所示）； (5) 计算上述10个RNA的表达权重，通过C0X比例风险回归模型，计算每个患者RFS 的风险指数，根据计算得出的RS值，将患者划分为高危和低危，判断患者复发风险大小， 并依该预测患者对于紫杉为基础化疗的敏感性；通过C0X多因素比例风险回归模型及 Time-dependent R0C曲线对所构建RNA模型的预测效能进行评价； (6) 将上述所得的RNA模型及计算公式，在三阴性乳腺癌患者中进行验证：获取独立 的另组三阴性患者的癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，利用实时定量PCR检测如SEQ ID No. 1-10所示RNA的表达量，并利用GAPDH作为内部参照进行校正；依据表达水平对 每个RNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值；判断每位患者的 复发风险，同时预测其对紫杉为基础化疗的敏感性；通过COX多因素比例风险回归模型及 Time-dependent ROC曲线对RNA模型的预测效能进行评价。
[0009] 具体而言，本发明所述的mRNA联合IncRNA模型构建与鉴定方法的步骤为： (1) 收集三阴性乳腺癌患者的手术切除癌组织标本； (2) 提取获得的组织的RNA样本； (3) 纯化组织的RNA样本； (4) RNA质量控制：用NanoDrop 2000光谱仪定量（NanoDrop Technologies, Waltham, ΜΑ)检测提取的总RNA的浓度及质量； (5 )将33对三阴性乳腺癌癌与癌旁组织进行全传录组芯片（Af fymetrix公司 GeneChip? Human Transcriptome Array 2.0芯片）检测，通过过滤，标化处理等步骤后， 将差异表达倍数不明显的探针去除，再利用生物信息学分析获得癌与癌旁组织差异表达的 RNA (包括mRNA和IncRNA);同时对另外132例三阴性乳腺癌癌组织进行HTA2. 0芯片检测， 将该结果与上述33例癌组织结果一同(共165例三阴性乳腺癌患者)组成训练集，和患者的 临床随访信息相关联，利用单因素 C0X比例风险回归模型，计算每个差异表达RNA与患者无 复发生存（RFS)的关系，进而筛选出即在三阴性乳腺癌中差异表达，同时又与疾病RFS相关 的 RNA (如 SEQ ID No. 1-10 所示）； (6) 计算上述10个RNA的表达权重，通过C0X比例风险回归模型，计算每个患者RFS的 风险指数（Risk Score (RS)):其指数的计算公式如下：RS=B1*X1+-+B10*X10,其中，X为每 个RNA在两分类方法中的赋值，B为每个RNA的权重系数；根据计算得出的RS值，将患者划 分为高危和低危，进而判断患者复发风险大小，并可依该预测患者对于紫杉为基础化疗的 敏感性；同时通过C0X多因素比例风险回归模型及Time-cbpendent R0C曲线对所构建RNA 模型的预测效能进行评价； (7) 将上述所得的RNA模型及计算公式，在独立的另外119例三阴性乳腺癌患者中进行 验证：招募119例三阴性患者组成独立的验证集，获取其癌组织，经过组织RNA抽提并质检 后，利用实时定量PCR检测如SEQ ID No. 1-10所示RNA的表达量，并利用GAPDH作为内部 参照进行校正；依据表达水平对每个RNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位 患者的RS值；依此判断每位患者的复发风险，同时预测其对紫杉为基础化疗的敏感性；通 过C0X多因素比例风险回归模型及Time-dependent R0C曲线对RNA模型的预测效能进行 评价。
[0010] 本发明经过严格细致的研究，构建了一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的 mRNA联合IncRNA模型；在预测24个月的RFS中，所述mRNA模型和混合模型均呈现出较好 预测效能，且明显优于常见的临床病理指标；同时该模型还可预测以紫杉为基础的化疗疗 效；与其他已知与疗效相关的临床病理因素相比，所述模型为一个独立的预测因素。本发明 所述模型能够为患者肿瘤治疗提供一定的建议，为医生治疗选择提供参考，进而减少不必 要治疗，实现个体化治疗，提高患者术后生存率。临床治疗中，在三阴性乳腺癌患者诊断明 确后，即可通过对上述RNA的检测，快速判断患者复发危险度及对于化疗的敏感性，并跟据 结果选择合适的治疗方案，实现个体化治疗。
【附图说明】
[0011] 图1是本发明实施例一二中mRNA联合IncRNA模型以及其他临床病理信息等因素 对于预测三阴性患者RFS的Time-dependent R0C曲线图，其中，结果明显显示相比较于其 他预测因素，mRNA联合IncRNA模型具有更大的曲线下面积；注：mRNA panel :单纯mRNA模 型；mRNA-lncRNA panel:mRNA联合IncRNA模型；Combined prognostic factors:常见临床 病理因素联合；Size :肿瘤大小；Grade :肿瘤分级；Node :淋巴结阳性个数。
【具体实施方式】
[0012] 以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明 具体条件的实验方法，按照制造试剂盒生产公司所建议的条件或按照常规实验条件，例 如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册（New York; Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件。
[0013] 实施例1:建立预测模型 一.实验对象： 本实施例的研究对象选择2011年1月至2012年12月间复旦大学附属肿瘤医院组织 库保存的三阴性乳腺癌组织165例，构成训练集，同时包括35例与癌组织配对的癌旁组织。 纳入及排除