梗染病后常 引起衰老或休眠茎干的顶部枯死，其上有时也长出黑色小点，即病原菌的分生孢子器。
[0047] 2. 2病原菌的分离和致病性测定
[0048] 对几十个石斛漆斑病标样进行划线分离和常规组织分离，5d后，培养皿上长出少 量细菌和不同的真菌，将这些细菌和真菌置于适宜的温湿度条件下对在相同铁皮石斛健康 的枝叶进行柯赫法则检验，发现这些细菌大都为芽孢杆菌，均为非致病菌；其中重复分离到 的一种真菌分离物为疑似病原物。将这种真菌分离物置于适宜的温湿度条件下在相同铁皮 石斛健康的枝叶进行接种检验，这些真菌分离物均对石斛叶致病，发病病症与田间基本一 致，通过分子生物方法鉴定为即为石斛漆斑病病原菌。
[0049] 2. 3病原菌分离物的形态及培养性状
[0050] 该病原菌在培养基上菌落圆形；边缘圆整，与多数菌不同，肉眼末见明显的因生长 面成的放射状缺刻；扩展较慢。在PSA培养基上白色，在有些人工添加氨基酸或无机氮的培 养基上其菌落背面呈粉红色。该病原菌在PDA、PSA培养基上培养10~15d后产生可见的 黑色的油滴状物质团，一般呈环带分布在菌落中央和接种菌丝块的周围；观察发现，这些油 滴状物质团是该死菌的分生孢子堆；实验还发现，类似炭疽病菌，该菌在机械损伤的菌落处 可产生大量的分生孢子堆。
[0051] 该菌较易产生无性孢子，其产孢量也大，其分生孢子堆垫状，分生孢子梗无色、 帚状重复分枝；分生孢子顶生于梗上、单细胞、椭圆形至短杆形，分生孢子大小（5~9) μmX(1~2. 5)μm，成团埋生于油滴状物质中。对田间采集的病样和人工培养菌落的大量 观察，末发现其有性子实体。
[0052] 2. 5病原菌鉴定
[0053] 根据对铁皮石斛漆斑病的病原菌分离物的形态学特征、培养性状和致病性测定 的研究结果（具体实验数据略），参阅文献（李宝聚等，2009)及吴文平（1991)对漆斑 菌属4个种的研究；确定铁皮石斛漆斑病是由半知菌亚门（Deuteromycotina)、丛梗孢 目（Moniliales)、瘤座菌科（Tuberculariaceae)、漆斑菌属（Myrothecium)、露湿漆斑菌 (MyrotheciumroridumTodeexFr.)引起的。
[0054] 2. 6不同培养基对石斛漆斑病菌菌丝生长的影响（具体结构见表2)
[0055] 在7种不同培养基上于25°C恒温下平皿培养实验显示：该菌在所有培养基上均 能生长、繁殖，但以荷叶煎汁培养基、PSA、OMA、石斛煎汁、树皮煎汁培养基上较为适宜，不 仅生长速度快，而且每皿产生的分生孢子数量大，其中以0MA培养基的产孢数量最大，可达 5. 17X109个/ml(表 2)。
[0056] 表2不同培养基对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响
[0057]
[0058] 注：r(t= 7d)为菌落面积日均增长率，r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均 增长率；t(s= 50% )为根据r(l〇git)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间（d); 培养温度25 °C。
[0059] 2. 7pH值对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响（表3)
[0060] 经测定石斛漆斑病菌在pH值5~12范围内均能生长，pH为6. 0~10. 0时较适 其生长繁殖，当pH值处于5. 0-6. 0间时，该菌能生长但不能产生分生孢子；pH值为7. 0、8. 0 为最适，期间菌落生长速度快，且产孢数达到最高值5. 63X109、6. 67X109 (表3)。因此本 试验说明该菌生长和繁殖pH值较为宽泛，最适pH值为7. 0~8. 0,在pH值为6. 0~10. 0 范围内均能症状，属喜欢中性偏碱的真菌。
[0061] 对于本发明的部分数据都进行了方差分析，各个处理之间的分析结果都标示在相 应的处理上，其中，当各个上标的字母不相同的时候（单个字母），表示他们之间存在显著 差异，如果上标的字母为2个或两个以上，表示他们之间没有差异，但是单个字母的处理与 2个字母的处理之间存在显著差异。本领域的一般人员看到这样的表示方法后容易明白他 们的关系。
[0062] 表3不同pH值对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响
[0063]
[0064] 注：r(t= 7d)为菌落面积日均增长率，r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均 增长率；t(s= 50% )为根据r(l〇git)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间（d); 培养温度25 °C。
[0065] 2. 8温度对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响（表4)
[0066] 经测定石斛漆斑病菌在pH值10°C~35°C范围内均能生长，15°C~35°C较适其生 长繁殖，其中，以30°C、25°C为最适，其菌落面积日均增长率分别为4. 993、3. 54 ;但该菌对 产孢的温度要求较高，20°C以上，35°C以下才能产生分生孢子盘，分泌足够多的孢子数量， 30°C为最适的生长和产孢温度，每皿的分生孢子数可达为3. 98X1010个/mL(表4)。
[0067] 上述实验结果说明，该菌生长和繁殖温度较为宽泛，最适温度为25°C~30°C，较 适温度范围为15°C~35°C，属喜欢中温偏高温的真菌。
[0068] 表4不同温度对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响
[0069]
[0070] 注：r(t= 7d)为菌落面积日均增长率，r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均 增长率；t(s= 50% )为根据r(l〇git)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间（d); 培养温度25°C。2. 9糖源对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响
[0071] 经20种不同糖源对石斛漆斑病菌菌丝生长、分生孢子形成的测定表明：该菌均能 利用本试验所提供的20种单糖、双糖、多糖作为糖源，其中以菊糖、鼠李糖、乳糖、山梨醇、 蔗糖较适宜于该菌菌丝生长，5d的菌落直径分别达45. 0、31. 5、30. 0、27. 5和26. 6mm，但鼠 李糖和山梨醇对分生孢子的形成并不十分有利，而乳糖上气生菌丝生长少，菌落也较薄，不 适于作为培养基；因此结合菌落的生长速度、产孢量及干重，认为蔗糖、葡萄糖、半乳糖、菊 糖和甘露糖是该菌的最适糖源（表5)。
[0072] 表5不同炭源对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响
[0073]
[0074]
[0075] 注：r(t= 7d)为菌落面积日均增长率，r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均 增长率；t(s= 50% )为根据r(l〇git)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间（d); 培养温度25°C。2. 10氨基酸对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响
[0076] 经27种有机氮和无机氮对石斛漆斑病菌菌丝生长及分生孢子形成的测定表明： 从表中可看出，极大多数氨基酸和无机氮有均利于该菌的菌丝生长，但该菌仅能利用部分 氨基酸和无机氮形成分生孢子，完成繁殖。其中以L-丙氨酸、亚硝酸钠、L-苏氨酸、L-脯 氨酸、谷氨酰氨较适宜菌丝生长（表6)。L-脯氨酸、谷氨酰氨、L-苏氨酸、L-丙氨酸、亚硝 酸钠适于分生孢子的产生，其中以L-脯氨酸为氮源的菌落每皿的产生的孢子数最多，可达 11. 8X107个/mL。其菌落生长也表现为厚实。因此，L-脯氨酸、亚硝酸钠、L-丙氨酸是适 宜该菌的氮源。
[0077] 表6不同氮源对石斛漆斑病菌菌丝生长和分生孢子形成的影响
[0078]
[0079]
[0080] 注：r(t= 7d)为菌落面积日均增长率，r(logit)为菌落面积的逻辑斯蒂值日均 增长率；t(s= 50% )为根据r(l〇git)值估算出的菌落生长至皿面积一半所需时间（d); 培养温度25 °C。
【主权项】
1. 一种用于培养铁皮石斛漆斑病菌的含有特异氨基酸的培养基，其中，该培养基的组 成如下：氮源化合物3g，磷酸氢二钾lg，硫酸镁（MgS04 ·7Η20) 0. 5g，氯化钾0. 5g，硫酸亚铁 0.Olg，糖源物质30g，琼脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物质为蔗糖、葡萄糖、半 乳糖、菊糖；所述的氮源化合物为L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝酸钾。2. 根据权利要求1所述的培养基，其中，糖源物质为菊糖。3. 根据权利要求1所述的培养基，其中，所述的氮源化合物为L-脯氨酸。
【专利摘要】本发明提供一种用于培养铁皮石斛漆斑病菌的含有特异氨基酸的培养基,其中,该培养基的组成如下：氮源化合物3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，糖源物质30g，琼脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物质为蔗糖、葡萄糖、半乳糖、菊糖；所述的氮源化合物为L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝酸钾。使用本发明的培养基和培养方法可以大量获得该病菌的孢子。
【IPC分类】C12R1/645, C12N1/14
【公开号】CN105349440
【申请号】CN201510960273
【发明人】方丽, 王连平, 王汉荣
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月18日