033] 5)凝胶的洗涤和洗脱:先分别以0.1~0.2mol/L的碳酸氢铵水溶液、0.2~0.4mol/ L的碳酸氢铵水溶液、0.1~0.3mol/L的氯化钠水溶液对步骤4所得凝胶进行洗涤，再以1.0 ~2.0m〇l/L的氯化钠水溶液进行洗脱，收集洗脱液；
[0034]优选的，所述步骤5中，各洗涤步骤中，所用的洗涤液的体积约为步骤3S/D法病毒 灭活后上清液的1/10~1/20;洗脱步骤中，所用的洗脱液的体积约为步骤3S/D法病毒灭活 后上清液的1/10~1/20。
[0035] 所述步骤5中，各洗涤步骤可充分去除凝胶上的FEIBA生成抑制因子，但又不至将 凝血因子洗脱下来。
[0036] 6)浓缩与换液:将步骤5所得的洗脱液进行浓缩，并进行缓冲液置换；
[0037]优选的，所述步骤6中，浓缩的方法为:采用5KD~20KD的超滤膜进行浓缩。
[0038]优选的，所述步骤6中，将洗脱液浓缩至紫外光谱吸收值A280nm = 40~80。
[0039]优选的，所述缓冲液置换为恒体积缓冲液置换。在本发明一实施例中，所述恒体积 缓冲液置换具体指缓冲液置换后溶液的体积与步骤5所得的洗脱液进行浓缩后的体积相 同。
[0040]优选的，所述缓冲液置换中所使用的缓冲液为0.05~0.2mol/L Tris-HCl、0.1~ 0.2mol/L氯化钠水溶液，pH7.0~8.0。
[0041 ] 所述0.05~0.2mol/L Tris-HCl、0.1~0.2mol/L氯化钠水溶液具体指该水溶液中 同时包括Tris-HCl和氯化钠。
[0042] 7)FEIBA的生成：将步骤6所得产物置于4°C~15°C静置10~30小时，孵育生成 FEIBA。
[0043]优选的，所述步骤7中，将步骤6所得产物置于8°C~12°C下。
[0044] 优选的，所述步骤7中，静置20~30小时。
[0045] 优选的，所述步骤7中，在步骤6所得产物中加入钙离子，再进行静置过程，静置生 成FEIBA后再加入金属离子螯合剂，去除游离钙离子。
[0046] 更优选的，加入钙离子至反应体系中钙离子浓度为0.1~lmmol/L。
[0047] 本领域技术人员可选择合适的方法调整体系中钙离子的浓度，并在反应后通过适 当的方式去除游离钙离子。在本发明一实施例中，通过在体系中添加氯化钙的方法调整钙 离子的浓度，并在反应后通过金属离子螯合的方法去除游离钙离子。
[0048] 更优选的，所述金属螯合剂选自Chelax R100、EDTA、柠檬酸钠、酒石酸、氨基三乙 酸等中的一种或多种的组合。
[0049] 检测步骤7所得产物的FEIBA含量以及凝血酶的含量，可知反应产物中的FEIBA活 性大于60U/ml，凝血酶含量低于0.003IU/ml。
[0050]本领域技术人员可选择合适的方法对步骤7所得产物进行后处理，具体举例来说， 对步骤七的产物，后期可以选择采用20nm膜对产物进行二次除病毒步骤;或为了增加产品 的安全边际，可向产物中添加终浓度为0.5U~1.5U/ml的肝素;也可以根据步骤7的检测结 果，采用超滤浓缩或者稀释的方法，对产物进行浓度调整;也可以同时向产物中添加或者以 超滤换液的方式，添加适当浓度的甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，组氨酸，等蛋白保护剂，以及山 梨醇，甘露醇，海藻糖等冻干赋形剂，用于后期冻干;也可以在冻干结束后，采用干热除病毒 的方法，比如l〇〇°C、30min，对产物进行二次除病毒步骤。
[0051]上述所例举的一些后处理工艺都是现有技术中已经被本领域技术人员熟练使用 的常规性工艺方法，本领域技术人员可根据实际需要，选择合适的工艺方法对步骤7所得产 物进行进一步处理。此外，如研究背景所述，FEIBA的具体成分在目前并无确切定论，可以确 定的是，FEIBA包含多种凝血因子成分，可能是多种凝血因子活化或者非活化的复合物，通 过FEIBA特定的生理功能设计的检测方法，可以对某种工艺生成的FEIBA进行检测，也可以 对其含量进行标定。
[0052]本发明进一步提供所述以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法在FEIBA 制备领域的用途。
[0053] 本发明发明人结合以往FE IBA研制经验，以血浆Cohn6+9改良法制备的组分III为 原料制备获得FEIBA。人血浆Cohn组分III富含维生素 K依赖的凝血因子，是制备凝血酶原复 合物的传统原料之一。目前大多数血制品公司的凝血酶原复合物的实际生产工艺，以组分I 上清为原料实际生产凝血酶原复合物并不多见。原因在于，在组分I上清中加入必要的离子 交换凝胶，将导致原下游整体工艺面临重大改变，对血制品企业的主导产品得率也将造成 不利的影响。因此选择组分I为原料进行凝血酶原复合物的生产，对血制品企业并无吸引 力。因此，如果以组分I上清为原料生产FEIBA产品，将面临同样的问题，要么损失这一部分 组分，要么申请对工艺参数变更进行备案，并且面临主导产品得率的下降的结果。而以组分 III为原料生产FEIBA，则不会遇到这个难题。因为，在工艺路线上，这既不影响以组分III生 产人凝血酶原复合物的工艺，也不会改变其他血制品产品的生产工艺，对企业来讲，能够更 加有效的利用组分III。利用本发明提供的FEIBA研制工艺，能够得到较高FEIBA活性的产 品，而凝血酶含量非常微弱。这对开发FEIBA大规模制备工艺，节约血浆资源，提高血液制品 的综合利用率，以及满足血友病人的用药需求有现实意义。
【具体实施方式】
[0054]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0055] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0056] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0057] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998;METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.ffassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0058] 本发明实施例中所使用的检测方法如下：
[0059] 1)微量凝血酶的定量检测：
[0060] 微量凝血酶的定量检测是本发明实施的重要基础。不同于大剂量凝血酶的检测， 本发明需要面临的检测问题是对微量凝血酶活性的检测。一些对微量凝血酶的检测方法并 不适合本发明，如凝血酶特异性的发色底物法等。本发明实施例中采用了一种微量凝血酶 的检测方法，其检测的凝血酶含量的下限可达0. 〇〇75IU/ml，甚至更低，具体方法如下：
[0061 ] 1、注射用水复溶凝血酶国家标准品(GB200 21105，5IU/V i a)后，以稀释液(0 · 7wt % 柠檬酸钠+〇 . 7wt % NaCl的水溶液）进行倍比稀释，得到2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、 0.031、0.015和0.0075IU/ml梯度浓度的凝血酶溶液。
[0062] 2、以注射用水复溶人纤维蛋白原制品（FNG)，如上海RAAS公司生产的HFNG (201202H2A0)，再以步骤1的稀释液(0.7wt %柠檬酸钠+0.7wt % NaCl的