红藻龙须菜多糖及其制备、抗肿瘤活性检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种大型海藻来源的多糖、其制备方法、抗肿瘤活 性的检测方法及应用，具体涉及一种红藻龙须菜多糖的提取和纯化、其制备方法、其抗肿瘤 活性的检测方法及其在抗肿瘤药物制备或作为增效剂的用途。
【背景技术】
[0002] 随着人口老龄化加剧、生态环境遭受破坏、不健康生活方式及食品安全问题等凸 现，肿瘤发病率和死亡率持续上升，给人们生活、健康及社会带来严重危害。常见的肿瘤药 物及放疗、化疗等治疗方法效果好但副作用较大。中医单独或辅助西药治疗肿瘤在提高机 体免疫力、延长生存期、降低复发转移率及减轻副作用等方面有着积极的意义。从研制创新 药物角度出发，海洋药物的研究是开发以传统中药为来源的新型天然活性药物的热点及重 要方向之一。《中草药大辞典》载药5767味，其中海洋药物144种（128味）；《中国海洋药物辞 典》收录海洋药物1600条，其中海洋藻类药物125条。美国国立肿瘤研究所每年筛选30，000 个新的抗肿瘤化合物，约5%来自海洋生物。目前国内外关于海藻抗肿瘤药物的报道日益增 多，我国海域辽阔，海藻资源丰富，利用藻类生产抗肿瘤物质很有潜力。如果能将资源丰富 的海藻开发为抗肿瘤药物，必将降低新药研制和开发的成本。
[0003] 龙须菜(Gracilariopsis Iemaneiformis)是红藻门、真红藻纲、杉藻目、江蓠科、 江蓠属大型海藻，主要分布于我国山东、辽宁、江苏、福建、海南等沿海地区，具有适应范围 广、生长快、含胶量高、适应环境能力强和营养价值高等优点。明代李时珍在《本草纲目》中 指出:龙须菜可以治癭结热气，利小便。因此，龙须菜对人体有着极为重要的保健功效，且营 养价值高，是"下八珍"的一珍。龙须菜性味甘、寒，主要入肝经，具有助消化、解积腻、清肠胃 和止血降压、软坚化痰、清热利水、温经止痛的功效。龙须菜富含活性多糖、藻红蛋白及膳食 纤维和营养元素等，具有免疫调节活性、降血脂、抗氧化、抗凝血、抗病毒、抗菌、抗炎镇痛等 多种生物学活性和药用保健功效，而且具有毒性小、药源丰富的特点。
[0004] 鉴于龙须菜是一种容易获得且生长快的海洋藻类资源，为了充分利用这种藻类资 源，本领域技术人员致力于进一步开拓其生物活性物质的用途。
【发明内容】
[0005] 为了进一步开拓龙须菜的生物活性物质的用途，本发明的一个方面提供了一种多 糖，其来自红藻类植物龙须菜，为981品种。
[0006] 本发明的另一方面，提供了一种龙须菜多糖在制备治疗肿瘤药物的增效剂中的应 用。
[0007] 进一步地，治疗肿瘤药物的增效剂是指上述龙须菜多糖与抗肿瘤药物顺铂联用， 能提高顺铂的抗肿瘤作用。
[0008] 进一步地，上述药物包括龙须菜多糖和药学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及 其他辅料。
[0009] 本发明的又一方面，提供一种龙须菜多糖在制备治疗肿瘤的药物、保健品或食品 中的应用。
[0010] 进一步地，上述肿瘤为胃腺癌、肺癌或子宫颈癌。
[0011] 本发明的再一方面提供一种制备上述龙须菜多糖的方法，包括以下步骤：
[0012] 1)用水溶解龙须菜干粉，并用NaOH调节溶液pH至9-11，离心获得第一上清液和第 一沉淀；
[0013] 2)在步骤1)中离心得到的第一沉淀中加入水溶解，并用NaOH调节溶液pH至9-11， 并再次离心，获得第二上清液；
[0014] 3)合并第一上清液和第二上清液，并加入三氯乙酸进行沉淀，离心获得第三上清 液；
[0015] 4)在第三上清液中加入无水乙醇进行沉淀，离心获得第二沉淀；
[0016] 5)用丙酮洗涤第二沉淀，并冷冻干燥，获得粗提龙须菜多糖；
[0017] 6)将步骤5)中的粗提龙须菜多糖溶于水，通过离子交换柱进行分步洗脱，真空干 燥后获得纯化的龙须菜多糖。优选地，离子交换柱为DEAE Sephadex A-25离子交换柱;用蒸 馏水、0.3mol/L NaCl和1.2mol/L NaCl溶液进行分步洗脱;分步洗脱后获得3种级分，将最 显著的级分作为纯化的龙须菜多糖进行后续实验。
[0018] 优选地，步骤1)和步骤2)中，用NaOH调节溶液pH至10。
[0019]进一步地，步骤3)中加入的三氯乙酸的质量浓度为2%_5%。优选三氯乙酸的质量 浓度为3 %。
[0020]本发明的又一方面提供一种检测上述龙须菜多糖抗肿瘤活性的方法，包括：
[0021 ] 1)将肿瘤细胞接种到新鲜培养基中，培养至对数生长期，并制成细胞悬液，接种至 多孔板中；
[0022] 2)待细胞贴壁后，将培养基替换为含有不同浓度的龙须菜多糖的培养基，并继续 培养24小时、48小时或72小时；
[0023] 3)将步骤2)中的培养基替换为含有CCK-8的培养基，继续培养后检测吸光度值；
[0024] 4)计算所述龙须菜多糖作用不同时间段对肿瘤细胞的增殖活力的影响，确定IC50 值。
[0025]进一步地，上述CCK-8的终浓度为8%-12%，检测波长450nm的吸光度值。优选的， 〇〇(-8的终浓度为10%。
[0026] 进一步地，上述肿瘤细胞为胃腺癌细胞MKN45、肺癌细胞A549和宫颈癌Hela细胞。
[0027] 本发明采用的龙须菜富含活性多糖，其龙须菜多糖作为海洋药物资源，具有良好 抗肿瘤效果，主要能够通过抑制肿瘤细胞的生长和增殖来发挥其抗肿瘤的作用，同时没有 明显的毒副作用。尤其是对人胃癌、肺癌、子宫颈癌和白血病等肿瘤均有良好的抑制作用， 其中又以对肺癌的抗肿瘤作用最明显，且这种抑制作用在一定浓度范围内具有时间-浓度 依赖性。另外，将龙须菜多糖与用于治疗多种实体瘤的一线用药顺铂联合使用，能够增强对 顺铂的抗肿瘤作用，尤其是对肺癌的抗肿瘤作用的增效作用显著。
[0028] 龙须菜多糖抑制肿瘤细胞的生长和增殖这种双重作用有利于肿瘤病人的综合治 疗和康复，适于联合用药，具有广阔的应用前景。龙须菜多糖作为一种新型的抗肿瘤多糖， 有望成为预防和治疗恶性肿瘤的辅助药物，值得进一步研究和开发成药用多糖或保健品多 糖或者相关食品，以提高龙须菜的经济利用价值。
[0029] 以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明的一个较佳实施例的龙须菜多糖的提取、纯化的结果图。
[0031] 图2是本发明的一个较佳实施例的龙须菜多糖对胃腺癌MKN45细胞生长和增殖的 抑制作用图。
[0032]图3是本发明的一个较佳实施例的龙须菜多糖对肺癌细胞A549细胞生长和增殖的 抑制作用图。
[0033] 图4是本发明的一个较佳实施例的龙须菜多糖对子宫颈癌Hela细胞生长和增殖的 抑制作用。
【具体实施方式】
[0034] 本发明中使用的各种试剂，除了有特别标注，均可以直接购买获得。
[0035]本发明的龙须菜多糖是从一类红藻类植物龙须菜（Gracilariopsis Iemaneiformis)中提取并初步纯化得到的多糖。龙须菜为981品种，采自浙江温州。
[0036]实施例1龙须菜多糖的提取及纯化
[0037]提取:龙须菜于2014年10月采自浙江温州，经反复清洗、去除泥沙等杂物，阴干粉 碎，保鲜袋冷藏保存。称取100g龙须菜干粉，加入700mL CldH2O，用NaOH中和调节pH至10。在 80°C的水浴中保温4小时，期间进行间歇性地搅拌。将上述溶液于8000rpm/min离心15min， 取上清液。为减少多糖损失，在沉淀中再加入5mL ddH20，并用NaOH调节pH至10，在80°C水浴 中保温4小时，期间进行间歇性地搅拌，然后将溶液于8000rpm/min离心15min，再次取上清 液。将第一次和第二次离心获得的上清液合并以提高多糖提取率，用草酸调节pH至7,在多 糖水提液中滴加3%与多糖水提取液等体积的三氯乙酸(Trichloroacetic acicUTCA)，混 匀，于25°C静置lh，将TCA沉淀后的溶液于8000rpm/min离心15min后除去胶状沉淀，得到无 蛋白质的多糖。用丙酮洗涤沉淀2次，冷冻干燥得到白色粉末状粗提龙须菜多糖。
[0038]纯化:将上述方法提取的粉末状粗提多糖复溶于水，取3ml样品过DEAE Sephadex A-25离子交换柱，用蒸馏水和3mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速0.5ml/min，每管5ml收 集100管，用蒽酮一硫酸法测定每管多糖浓度。在此基础上，再用蒸馏水、〇.3mol/L NaCl和 1.2mol/L NaCl溶液分步洗脱，流速0.5ml/min，每管5ml收集，将含糖量较高的洗脱液减压 浓缩后，透析去盐，真空干燥得到各多糖组分。结果显示：利用DEAE-Sephadex A-25离子交 换柱进行分步洗脱，可以得到3个明显的吸收峰（图1)，表明本发明的这个实施例中提取及 纯化获得的龙须菜多糖至少含有3种级分。收集这3种级分，依次命名为P-I、P-2和P-3,3种 级分占上样量的比率分别3.56%、69.37%、18.29%。将上述真空干燥后获得的最显著的级 分P-2加入CldH 2O配成lmg/mL母液，过滤除菌，分装，4°C保存备用，以此进行抗肿瘤活性检 测。
[0039]实施例2龙须菜多糖对胃腺癌细胞MKN45生长和增殖的抑制作用
[0040]胃腺癌细胞MKN45为贴壁细胞，细胞复苏后以5