一种携带gfp的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染 性克隆载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 病毒的侵染性CDNA克隆是指RNA病毒具有侵染性的CDNA或CDNA具有侵染性的体外 转录物，接种寄主植物后表现与野生毒源一致的症状。cDNA侵染性克隆的建立克服了RNA病 毒难以遗传操作的瓶颈，使在DNA水平上应用基因重组等相关技术开展分子生物学研究得 以实现。如:对病毒侵染性克隆利用定点突变技术研究病毒基因组及其基因功能;对其改造 为基因沉默载体开展植物功能基因组学的研究;将报告基因插入病毒侵染性克隆中直观地 观察和研究病毒在植物体内运动和积累情况;此外，还可研究病毒致病性方面的问题，如症 状发生、种子和昆虫传播等机理。
[0003] 在病原菌侵染寄主植物途径的研究中，常利用荧光素酶基因 （lux )和β-葡萄糖 苷酸酶基因（gus)等标记病原菌，进行跟踪检测，但荧光素酶检测时需向试验材料内渗入 荧光素;而葡萄糖苷酸酶进行组织化学分析时，需要昂贵的反应底物，并且基因标记能够 破坏病原菌，在进行组织处理时也会阻断植物病原菌的继续侵染。因此，在病原菌侵染寄主 植株途径的研究中一直未取得可靠的实时实态过程。绿色焚光蛋白（Green fluorescent protein，GFP)是1962年从发光水母中发现，由于其本身是一种发光蛋白，具有稳定、直观、 操作方便的荧光性质。利用GFP标记靶标微生物是目前研究微生物和宿主互作的重要手段， 与抗生素抗性标记和放射性同位素标记等方法相比，GFP标记因为对菌株影响小，易操作， 并可以直接观察和评估定殖效果而受到国内外研究者的重视。作为报告基因，GFP具有如下 优点：（1)绿色荧光蛋白基因的表达不需要借助辅助因子以及其他外源底物，在荧光显微镜 下就能直接观察到绿色荧光，具有方便、快速、灵敏度高等特点，且还可以通过荧光强度，衡 量其在单细胞水平的表达量。（2)绿色荧光蛋白无毒性，对活细胞无毒害，不影响目的基因 的功能，转化后细胞仍可连续传代，其分子结构及荧光特性相当稳定，对光漂白、碱性、适当 高温、除垢剂、有机溶剂和大多数普通酶等有较强的耐受性。（3)易于载体构建:绿色荧光蛋 白的编码序列较小仅717bp左右，可与目的基因整合到同一个质粒中，避免载体过大而引 起带来转化效率过低的问题。（4)能够对活细胞进行实时定位观察。通过GFP标记病原菌 研究其侵染寄主的过程，最大程度的接近自然真实状态。
[0004] MNSV属于香石竹斑驳病毒属(Carmovirys)，主要通过种子、土壤真菌和黄瓜黑头 叶甲、机械摩擦接种进行传播，该病害随种子调运远距离传播将会严重影响我国甜瓜生产。 MNSV基因组很小，只有4.3kb，是非常好的基因工程材料，侵染性克隆的成功使对该病毒的 研究易于在DNA水平上进行操作，通过基因工程改造该基因，加快MNSV功能基因组学的研 究，为揭示其基因功能奠定基础。GFP稳定性好，表达载体容易构建，适合作为标记基因跟 踪病原菌研究其发生发展规律。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就在于克服现有技术的不足而提供一种携带GFP的甜瓜坏死斑点病 毒侵染性克隆载体及其构建方法。
[0006] 本发明的目的是以下述技术方案实现的： 一种携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，它是由GFP全长基因融合到丽SV侵 染性克隆载体PCB301-MNSV的cp基因后面获得的。
[0007] 如上甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤： (1) 分别利用RT-PCR的方法获得GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因； (2) 将步骤（1)获得的GFP片段和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因通过 Infusion-HD酶连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选并提取获得含有GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵 染性克隆载体pMNSV-GFP。
[0008] 步骤(1)中用来扩增甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因的引物为:MNSV-GFP-F：5;-CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTTAATTTATTGCACTCCAAATC_3\MNSV-GFP-RJ'-AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCC GGA G_3';该 引物用来扩增MNSV的全基因组序列，并去掉cp基因终止密码子，划线部分为融合的GFP序 列。
[0009] 步骤（1)用来扩增GFP全长基因序列的引物为:GFP-F: 5 ^ ~CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT-3;；GFP-R：5;-GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTT GTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3\划线部分为融合的MNSV的部分序列。
[0010] 步骤(l)PCR扩增所用的模板为pCB301-MNSV质粒模板。
[0011 ]步骤(1 )PCR扩增所用的模板为含有GFP基因的质粒pBI 22卜GFP。
[0012] 一种如上所述携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的验证方法为，通过 农杆菌冻融法把携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌 注射接种寄主植物甜瓜子叶，观察甜瓜幼苗的发病情况，证实携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒 载体为具有侵染性的载体PMNSV-GFP。
[0013] 本发明采用同源重组的方式将GFP全长基因融合到甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆 载体的cp基因后面，然后通过转入农杆菌宿主细胞GV3101，摩擦接种到甜瓜上证实其具有 侵染性，并通过激光共聚焦观察到GFP的成功表达，可及时跟踪MNSV病毒的发展情况。MNSV 基因组很小，只有4.3kb，是非常好的基因工程材料，侵染性克隆的成功使对该病毒的研究 易于在DNA水平上进行操作，通过基因工程改造该基因，加快MNSV功能基因组学的研究，为 揭示其基因功能奠定基础。GFP稳定性好，表达载体容易构建，适合作为标记基因跟踪病原 菌研究其发生发展规律，将GFP基因与MNSV融合，实现对该病毒的荧光标记，借助荧光显微 镜，真实反映该病毒在植株中的分布，明确病毒在植物体内的运动和定植，直观地呈现了 MNSV侵染的动态过程，不仅为病原菌与寄主互作和致病机理的研究提供了依据，也为病 害的科学防治提供了参考。
【附图说明】
[0014] 图1是MNSV侵染性克隆载体pCB301-MNSV图谱； 图2是携带有GFP基因 pBI221-GFP载体图谱； 图3是携带了GFP基因的MNSV侵染性克隆载体pMNSV-GFP图谱； 图4是通过激光共聚焦观察携带有GFP的MNSV接种后甜瓜叶部和根部图（仪器型号： Leica TCS SP5;在激发光488nm的波长条件下观察）。
【具体实施方式】
[0015] 一种携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，它是由GFP全长基因融合到 MNSV侵染性克隆载体pCB301-MNSV(专利CN2015105541484)的cp基因后面获得的，如图3所 示;所述GFP和MNSV融合基因如序列SEQ ID N0:05所示。MNSV基因组只有4.3kb，是非常好的 基因工程材料，该病毒侵染性克隆的成功使对该病毒的研究转到DNA水平上。在把GFP基因 融合到MNSV的试验方案上，申请人层尝试把GFP融合到病毒组分的其他部位，结果发现把 GFP融合到MNSV cp基因后，其对寄主植物的致病力强，且表达稳定。因此，申请人采用把GFP 融合到MNSV cp基因后，实现了对该病毒的荧光标记，借助激光共聚焦显微镜，真实反映该 病毒在植株中的分布，明确病毒在植物体内的运动和定植，直观地呈现了 MNSV侵染的动 态过程，为病原菌与寄主互作和致病机理的研究提供了依据。
[0016]此外，该发明利用了融合PCR和重组酶的特点构建了MNSV携带有GFP的方法与传统 的酶切连接方式相比，最突出的优点是不受限制性内切酶位点的影响，不引入外源的酶切 位点，对侵染性克隆的影响最小，利用该方法对该侵染性克隆载体进行随意的缺失、突变及 替换等多种基因工程手段进行改造，该方法既节省了工序，又提高了重组的阳性率，避免了 实验的繁琐及内切酶的限制。
[0017] 上述携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤： (1)分别利用RT-PCR的方法获得GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因；在设 计扩增丽SV及GFP全长基因的引物时，利用了重组融合的方法，丽SV基因5'和3'端分别重组 了 24bp和20bp的GFP序列；在扩增GFP基因时5'和3'端两端序列分别融合了MNSV的23bp和 20bp的序列； ①获得甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因：设计引物为MNSV-GFP-F: 5' -CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTT AAT TTA TTG CAC TCC AAA TC-3 \ MNSV-GFP-R:5 ^AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCC GGA G_3';该引物用来扩增 丽SV的全基因组序列，并去掉cp基因终止密码子，划线部分为融合的GFP序列；20yLRT-PCR 扩增标准反应体系：4.0yL 5XPCR buffer，2 yL正向和反向引物混合物(各10μΜ)，0.2 μ LTaq DNA聚合酶(5 Μ/μυ，1 yL pCB301_MNSV质粒模板(如图1所示，MN