SV的全长基因置 于35s启动子和35s-t终止子中间，该载体具有在植物中表达的能力，能够侵染MNSV的寄主 植物甜瓜），补充ddH 20至20μΙ^ΡΟ?反应循环参数:94°C预变性5min;94°C变性40 s，60°C退 火40s，72°C延伸50s，循环30次；最后72°C 10 min;以上用到的各种试剂均购自大连 TaKaRa公司。
[0018] ②获得GFP全长基因：设计引物为GFP-Fd'-CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT~3;；GFP-R：5;-GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTT GTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3';划线部分为融合的MNSV序列；该引物用来扩增717bp的 全长GFP序列；20yLRT-PCR扩增标准反应体系：4.0yL 5XPCR buffer，2 yL正向和反向引 物混合物(各10μΜ)，0·2 yLTaq DNA聚合酶(5 Μ/μυ，1 yL PBI221-GFP模板(如图2所示， 购自上海生工生物公司），补充ddH20至20yL 1CR反应循环参数:94°C预变性5min; 94°C变 性40 s，60°C退火40s，72°C延伸50s，循环30 次；最后72°C 10 min。
[0019] (2)将步骤(1)获得的GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因用1%的琼脂糖 胶检测，按照回收试剂盒(大连TaKaRa公司）说明书进行回收。用Infusion-HD重组酶(购自 Clontech公司）把回收的GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因连接到。重组酶连接 体系为:GFP基因片段:2yL;甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因：3yL，Infusion-HD酶:5 yL，共计10yL，置于50 °C，30min，随后把产物转化大肠杆菌DH5a，涂布在含有kan抗生素的平 板上，37°C培养，筛选含有甜瓜坏死斑点病毒的全基因组及GFP的全长基因的克隆载体，即 为携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体pMNSV-GFP，用碱裂解法抽提质粒载体。
[0020] 将上述携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体pMNSV-GFP转入农杆菌，并通过摩擦 接种证实该载体的侵染性，具体包括以下步骤： (1)转入农杆菌：采用冻融法，将上述pMNSV-GFP转入农杆菌GV3101感受态细胞，具体 为:加入lyg的重组载体，置于冰上30min，液氮中速冻5min，37°C 5min，加入500μ1的不含有 任何抗生素的LB培养基中，28 °C慢速培养4-6h，涂布于含有50μg/ml的Km、10μg/ml四环素和 50μg/ml的Rif的3种抗生素的LB固体培养基平板上28°C培养约48h;利用菌落PCR的方法筛 选阳性转化子。
[0021] (2 )农杆菌注射接种及致病性鉴定:把筛选到的阳性转化子接种到含有50μg/ml的 Km、10μg/ml四环素和50μg/ml的Rif的3种抗生素的LB的液体培养基中，28°C 200rpm培养 至0D600为1.0左右，6000rpm lOmin离心收集沉淀，重悬与含有10mM Mgcl2，10mM MES，150y m的乙酰丁香酮的浸润缓冲液中，调整0D600至1.0，静置4h后注射接种两叶一心的甜瓜子叶 的背部，接种后把甜瓜苗保持在黑暗中l〇h后，22°C培养。观察甜瓜幼苗的发病情况，检测甜 瓜坏死斑点病毒克隆载体的侵染性。接种后每天观察发病情况。接种4天后，接种的子叶开 始出现局部的坏死斑点症状，至第8天时，子叶的枯斑开始连片出现，真叶也陆续出现坏死 斑点症状，经RT-PCR检测显示，接种后大部分植株表现阳性，发病率达90%(发病27/30)。通 过激光共聚焦显微镜观察发病的植株的根部和叶片，可以明显发现GFP在根部和叶片中表 达，如图4所示，a-c为接种叶片，a为在激光下暗场，b为明场，c为两个叠加;d-f为根部，d为 在激光下暗场，e为明场，f为两个叠加，绿色荧光部分（图中灰色所示)为GFP的表达。同时， 随后将发病的植株经摩擦接种回接到健康的甜瓜植株上，接种7天后植株均表现明显的枯 斑症状，说明构建的侵染性克隆能够摩擦接种传播。由此证实携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒 侵染性克隆载体pMNSV-GFP构建成功。
[0022] <11〇>中国农业科学院郑州果树研究所 〈120> -种携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体 <130> 1 <160> 5 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213>引物 <400> 1 catggcatgg atgaactata caaatttaat ttattgcact ccaaatc 47 〈210〉 2 〈211〉 46 〈212〉 DNA 〈213〉引物 〈400〉 2 aaaagttctt ctcctttact catggcgagg taggctgttt ccggag 46 〈210〉 3 〈211〉 46 〈212〉 DNA 〈213〉引物 〈400〉 3 ctccggaaac agcctacctc gccatgagta aaggagaaga actttt 46 〈210〉 4 〈211〉 47 〈212〉 DNA 〈213〉引物 〈400〉 4 gatttggagt gcaataaatt aaatttgtat agttcatcca tgccatg 47 〈210〉 5 〈211〉 4978 〈212〉 DNA 〈213〉MNSV+GFP 融合基因 〈400> 5
上述MNSV+GFP序列中划线部分为GFP全长基因。
【主权项】
1. 一种携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，其特征在于：它是由GFP全长基 因融合到丽SV侵染性克隆载体pCB301-MNSV的cp基因后面获得的。2. 如权利要求1所述的携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特 征在于包括以下步骤： (1) 分别利用RT-PCR的方法获得GFP和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因； (2) 将步骤（1)获得的GFP片段和甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因通过 Infusion-HD酶连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选并提取获得含有GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵 染性克隆载体pMNSV-GFP。3. 如权利要求2所述的携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特 征在于步骤(1)中用来扩增甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆全长基因的引物为:MNSV-GFP-F: 5 ;~CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTTAATTTATTGCACTCCAAATC_3\MNSV-GFP-RJ'-AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCC GGA G_3';该 引物用来扩增MNSV的全基因组序列，并去掉cp基因终止密码子，划线部分为融合的GFP序 列。4. 如权利要求2所述的携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特 征在于步骤（1)用来扩增GFP全长基因序列的引物为:GFP-F: 5' ~CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT~3;；GFP~R：5;~GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTT GTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3\划线部分为融合的MNSV的部分序列。5. 如权利要求3所述的携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特 征在于步骤(1 )PCR扩增所用的模板为pCB301-MNSV质粒模板。6. 如权利要求4所述的携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特 征在于步骤(l)PCR扩增所用的模板为含有GFP基因的质粒pBI221-GFP。7. -种如权1-6任一项所述携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的验证方法， 其特征在于：通过农杆菌冻融法把携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体转入农杆菌 GV3101中，通过农杆菌注射接种寄主植物甜瓜子叶，观察甜瓜幼苗的发病情况，证实携带 GFP的甜瓜坏死斑点病毒载体为具有侵染性的载体pMNSV-GFP。
【专利摘要】本发明涉及到香石竹斑驳病毒属(<i>Carmovirμs</i>)的甜瓜坏死斑点病毒（<i>Melon？necrotic？spot？virus</i>,？MNSV），在该病毒侵染性克隆获得的基础上构建了携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒克隆载体，并进行了致病性分析，证实该携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒的克隆载体为侵染性克隆载体。携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体是把GFP的全长基因通过融合PCR的方法与甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV连接，获得的具有侵染性克隆的重组表达载体。该载体通过冻融法转入农杆菌菌株GV3101中，获得对甜瓜植物具有高效侵染能力且携带有GFP的病毒载体pMNSV-GFP。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/82
【公开号】CN105567728
【申请号】CN201610030358
【发明人】吴会杰, 古勤生
【申请人】中国农业科学院郑州果树研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月18日