鉴定抗als抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法及专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鉴定抗性播娘蒿的方法及专用引物，具体涉及鉴定抗ALS抑制剂类除 草剂的播娘蒿的方法及专用引物，其中，鉴定方法基于酶切扩增多态性序列（Aleaved Amplified Polymorphic Sequences,CAPS)和衍生酶切扩增多态性序列(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，dCAPS)实现，能够快速、准确鉴定抗ALS抑制剂类除草 剂的播娘蒿的靶标基因的突变位点及突变氨基酸类型，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 播娘蒿是小麦田常见恶性杂草之一，在我国的东北、华北、西北、华东、四川等地区 均有分布。该杂草发生严重的小麦田，会造成小麦大量减产，导致小麦减产最高可达 39.36%。化学除草是防治播娘蒿的有效方法。
[0003] 苯磺隆是防治播娘蒿的主要除草剂，其应用面积约占小麦田化学防治面积的 70 %。苯磺隆通过抑制杂草体内ALS酶的活性，使支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生 物合成受阻，导致杂草体内蛋白质合成受阻，最后使杂草因营养缺乏而死亡。苯磺隆在我国 小麦主产区的连年使用，导致了抗药性杂草种群的出现。抗性播娘蒿种群的出现对有效防 治播娘蒿提出了挑战，快速确定抗性播娘蒿的发生情况，是制定有效防治措施的关键。
[0004] 目前研究表明，播娘蒿体内ALS酶的197位氨基酸、199位氨基酸、376位氨基酸和 574位氨基酸发生突变是播娘蒿对苯磺隆产生抗性的分子机理。此外，播娘蒿有2个ALS基 因，且在抗性播娘蒿植株中只检测到其中一个ALS基因发生突变。采用基因同源克隆和直接 PCR产物测序是检测抗性播娘蒿突变位点的主要手段。
[0005] 基因同源克隆需要将目的基因与载体连接，然后转入感受态细胞，活化、培养、检 测，再送测序公司测序，最后进行序列分析，确定基因的突变情况。这种方法费时、费钱、效 率低。
[0006] 采用PCR产物直接测序，虽然得到测序结果速度快，但是测序图容易出现杂峰和套 峰，实验的准确性受到影响。
[0007] 酶切扩增多态性序列(Aleaved Amplified Polymorphic Sequences,CAPS)是根 据已知基因序列设计特异引物，需检测的突变位点被包含在某种限制性内切酶的酶切识别 位点之内，然后选择合适限制性内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切图谱来检测突变位点 的一种技术。
[0008] 衍生酶切扩增多态性序列（Der i ved Cleaved Amp 1 if ied Polymorphic Sequence，dCAPS)是通过在引物中导入错配碱基使扩增序列产生酶切位点的变相的CAPS技 术。
[0009] 上述两种技术具有操作简便（用琼脂糖凝胶电泳分析）、DNA用量少、结果准确、检 测效率高、成本低廉等优点，已被广泛应用于白菜、茶树、西瓜等分子标记育种研究中。
[0010] 但是，将上述两种技术用在抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的检测中尚未见报道。
【发明内容】
[0011]本发明的第一个目的在于提供鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿专用引物，该 专用引物特异性强，可直接用于抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的鉴定。
[0012]为了实现第一个目标，本发明采用如下的技术方案：
[0013] 鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿专用引物，其特征在于，包括6对引物，引物的 序列见表1:
[0014] 表1引物的序列
[0015]
[0016] 本发明的第二个目的在于提供一种利用上述专用引物鉴定抗ALS抑制剂类除草剂 的播娘蒿种群的方法，该鉴定方法能够快速、准确鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的靶 标基因的突变位点及突变氨基酸类型。
[0017]为了实现第二个目标，本发明采用如下的技术方案：
[0018] -种鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0019] (1)、DNA提取:对待测种群单株叶片提取基因组DNA;
[0020] (2)、PCR扩增：以待测材料的基因组DNA为模板，分别用表1中的6对引物进行PCR扩 增；
[0021 ] (3)酶切:用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；
[0022] (4)电泳:对酶切产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0023]所述的鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，在步骤（2)中， PCR反应体系如下：
[0024]
[0025] 其中，引物F和引物R的浓度均为1 ΟμΜ。
[0026] 所述的鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，在步骤(2)中，采 用的PCR条件为:预变性94 °C 3min; 94 °C变性30s，60 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，34个循环；最 后 72°C 延伸 lOmin。
[0027] 所述的鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，在步骤(3)中，不 同引物扩增的PCR产物从表2中选择对应的限制性内切酶进行酶切：
[0028] 表2不同PCR产物对应的限制性内切酶
[0029]
g
[0030] 所述的鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，在步骤(3)中， [0031 ] Scal-HF与Spel的酶切体系如下： 限制性内切酶 0.5 μ.Ε PCR产物 5 μL
[0032] CutSmart Buffer 2: pL ddH20 12 5 'liL 酶切温度及时间 37°C，10:h
[0033] 失活条件 80°C，20min
[0034] Bsal与HpyCH4IV酶切体系如下： 限制性内切酶 0.5 PCR产物 5 CutSmart Buffer 2 pL
[0035] ddH20 12.5 .uL 酶切温度及时间 37°C，lOh 失活条件 65°(D，. _20.min
[0036] Nsn酶切体系如下： 限制性内切酶 0.5 )iL PCR产物 5 pL 3.1 Buffer 2pL
[0037] ddH20 12.5 μL 酶切温度及时间 37C, lOh 失活条?'?. 65 C, 20 min
[0038] Mfe頂每切体系如下： 限制性内切酶 0.5 pL PCR 产物 5 ,uL
[0039] CutSmart Buffer 2 p.L 。 ddH,(> 12 5 μL. 酶切温度及时间 37°C，2h
[0040] 本发明的有益之处在于：
[0041] ( -）、本发明设计的专用引物，可直接用于抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的鉴 定，相对同源克隆及PCR产物检测基因突变位点的方法，操作简单，成本低廉，重复性好，结 果准确；
[0042](二）、本发明提供的利用专用引物鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，大 大缩短了鉴定抗性播娘蒿材料的时间，只需2.5h就可得到准确的鉴定结果，提高了工作效 率；
[0043](三）、本发明提供的利用专用引物鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，对 于制定有效防治抗性播娘蒿的措施具有重要理论参考价值和实效性。
【附图说明】
[0044]图1是1号材料的酶切图，Μ为DL-2000，1为49号3单株混样，2-7为1号6个单株材料； [0045]图2(a)是4号材料的酶切图，Μ为DL-2000，1为49号3单株混样，2-7为4号6个单株材 料；
[0046] 图2(b)是129号材料的酶切图，Μ为DL-2000，1为49号3单株混样，2-6为129号材料5 个单株；
[0047] 图3是97号材料的酶切图，Μ为DL-2000，1为49号3单株混样，2-8为97号7个单株材 料；
[0048] 图4是98号材料的酶切图，Μ为DL-2000，1为49号3单株混样，2-12为98号11个单株 材料；
[0049] 图5是118-1号材料的酶切图，Μ为DL-2000，1为49号3单株混样，2-12为118-1号的 11个单株材料；
[0050] 图6(a)是118-2号材料的酶切图，Μ为DL-2000，1为49号3单株混样，2-6为118-2号 的5个单株材料；
[0051 ] 图6(b)是143号材料的酶切图，Μ为DL-2000，1为49号3单株混样，2-5为143号的4个 单株材料。
【具体实施方式】
[0052] 若未特别指出，以下列举的实施例所采用的技术手段均为分子生物学领域常规方 法。
[0053] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0054] 第一部分:开发专用引物
[0055] 一、实验材料
[0056]供试播娘蒿种群均采自河北省小麦田或荒地，其中，
[0057] (1)华店乡种群(49号)采自荒地，作为敏感种群；
[0058] (2)抗性种群为铜冶镇种群（1号）、宋曹镇种群(4号）、白神首种群(97号）、东汪镇 种群(98号）、屯庄营种群（118-1号）、屯庄营种群（118-2号）、蒲阳镇种群（129号)和定兴镇 种群（143号）。
[0059]上述种群均采自施用过苯磺隆的小麦田。
[0060] 采用盆栽法测定抗性种群对苯磺隆的抗性水平。测定结果表明，上述抗性种群对 苯磺隆均表现出高抗水平。
[0061] 本发明涉及的ALS抑制剂类除草剂包括:磺酰脲类除草剂、咪唑啉酮类除草剂、嘧 啶硫代苯甲酸酯类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂和黄酰胺羰基三唑啉酮类除草剂。
[0062] 二、提取基因组DNA
[0063]随机选择49号种群3棵单株混样，1号种群6棵单株，4号种群6棵单株，97号种群7棵 单株，98号种群11棵单株，118-1号种群10棵单株，118-2号种群5棵单株，129号种群5棵单 株，143号种群4棵单株