一种b亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法及其试剂盒和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鸡标记辅助选择技术领域，具体涉及一种用于鸡标记辅助选择的B亚 群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法及其试剂盒和应用。
【背景技术】
[0002] 禽白血病(Avian leucosis，AL)主要是由禽白血病病毒(Avian leucosis virus, ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类免疫抑制性肿瘤性传染病。禽白血病病毒不仅 引发肿瘤，导致鸡群大批死亡，禽白血病病毒亚临床感染还常常引发生产性能，包括生长 率、肉品质、产蛋率和受精率等降低、鸡免疫抑制和易致其他病原继发感染，给养禽业造成 重大的经济损失。
[0003] 目前，由于没有有效药物和疫苗，禽白血病的主要防控措施是降低鸡群的感染率 以及建立无白血病的种鸡群，其主要手段是通过对鸡群定期进行禽白血病病毒(ALV)检测 淘汰阳性鸡的方法来净化和消除鸡群中的ALV。然而，禽白血病净化是一项成本昂贵、工作 量大且持久的工程;尤其在生产系统低下且养殖环境复杂的发展中国家，净化措施并不能 完全控制禽白血病的发生与流行。因此，通过抗病育种改善宿主抗病力被人们认为是防控 禽白血病的一项新策略。
[0004] B亚群禽白病病毒是我国肉鸡主要流行的禽白血病病毒之一。研究表明，B亚群禽 白病病毒通过与宿主上的特异性受体结合侵染动物机体，编码B亚群禽白病病毒受体的tvb 基因突变与禽白血病抗性相关，如位于c.172C>T突变使受体基因 tvb产生提前终止密码子， 影响受体与病毒的结合，从而使宿主产生抗B亚群禽白血病病毒感染的能力。我们前期在 tvb基因第4外显子上发现一个新突变C.298C>T，该突变同样可导致tvb产生提前终止密码 子，从而使宿主产生B亚群禽白血病病毒抗性。但目前关于tvb基因 C.298C>T位点作为B亚群 禽白血病遗传抗性分子标记的检测方法研究还较少。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术的不足，本发明提供了一种鸡B亚群禽白血病抗性的分子标记鉴 别方法及其试剂盒和应用。
[0006] 本发明以鸡B亚群禽白血病病毒受体基因 tvb的DNA全长序列（参考序列GeneBank 登录号为NC_006109.3)为研究对象，寻找该受体基因上影响鸡B亚群禽白血病抗性突变位 点以及相应的多态性检测方法，通过在多个群体中的验证，发现了位于鸡B亚群禽白血病病 毒受体基因 tvb的某段序列（SEQ ID N0:3)中的第166位碱基具有单核苷酸多态性。且当该 处碱基为C时，鸡为B亚群禽白血病易感型，当该处碱基为T时，鸡为B亚群禽白血病抗性型。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法， 通过检测鸡tvb基因的DNA片段上的第166位SNP位点是否发生突变来鉴别被检测鸡为遗传 抗性型还是遗传易感型；
[0008] 当所述鸡tvb基因的DNA片段上的第166位碱基为C时，则判断所述鸡为B亚群禽白 血病易感型；当所述鸡tvb基因的DNA片段上的第166位碱基为T时，则判断所述鸡为B亚群禽 白血病抗性型。
[0009] 优选的，所述方法包括如下步骤：
[0010] (1)以所述鸡tvb基因的DNA序列为模板，设计引物对所述鸡tvb基因的DNA片段进 行扩增；
[0011] (2)将所得扩增产物用限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测所得酶切产 物；
[0012] 若只有一条509bp的条带，则该突变位点处均为C碱基，判断为CC基因型，表现为B 亚群禽白血病敏感型；
[0013] 若有2条分别为343bp和166bp的条带，则该突变位点处均为T碱基，判断为TT基因 型，表现为B亚群禽白血病抗性型；
[0014] 若有3条分别为509bp、343bp和166bp的条带，则该突变位点处一条链为C碱基，另 一条链为T碱基，判断为CT基因型，因为C等位基因是显性，所以表现为B亚群禽白血病敏感 型。
[0015] 优选的，所述步骤(1)中的引物如SEQ ID N0:1~2所示：
[0016] 正向引物：5，-ATGTGGGCAAGGTAAAACTC-3，，
[0017] 反向引物：5'-GGTGATGATGATCCATAAAGC-3'。
[0018]优选的，所述步骤(2)中的限制性内切酶为BsaA頂每。
[0019] 本发明的第二个目的是提供一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别试剂 盒，所述试剂盒包含正向引物和反向引物、PCR反应混合物、Taq DNA聚合酶、双蒸水、缓冲液 和限制性内切酶BsaA I，所述正向引物和反向引物的序列为：
[0020] 正向引物：5，-ATGTGGGCAAGGTAAAACTC-3，，
[0021 ]反向引物：5，-GGTGATGATGATCCATAAAGC-3，。
[0022]本发明的第三个目的是提供B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法在分子 标记辅助选择中的应用，特别是在鸡B亚型禽白血病抗性选择育种中的应用。
[0023 ]本发明的鉴别方法和试剂盒准确性高、成本低、效率高。通过本发明的鉴别方法和 试剂盒，有利于判断目标鸡群对B亚群禽白血病抗性性状的基因型，从而能有目的对鸡群进 行选择，提高其后代鸡群对B亚群禽白血病的抵抗力。
【附图说明】
[0024]图1是鸡tvb基因上的DNA片段PCR扩增后的电泳结果图，其中，泳道L1、L2代表2只 白来航鸡，泳道Y1、Y2代表2只北京油鸡，Μ为分子量标准；
[0025]图2是应用本发明的方法对白来航鸡和北京油鸡的tvb基因片段进行比对的结果 图，其中，L1、L2代表白来航鸡，Y1、Y2代表北京油鸡，图中方框所示的为该序列在166位碱基 处存在的C/T突变位点；
[0026]图3是PCR产物用BsaA頂每进行酶切反应后的三种基因型CC、CT和ΤΤ的电泳图谱，Μ 为分子量标准。
【具体实施方式】
[0027]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0028]实施例1:鸡B亚群禽白血病抗性分子检测方法的建立
[0029]( -）引物：
[0030] 以鸡tvb基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006109.3)为模板，设计 一对引物扩增得到如序列SEQ ID N0:3所示的DNA序列，包括完整的第4、5外显子，部分第6 外显子，以及部分第3外显子和完整的第4、5内含子，该序列全长为509bp。所用到的引物序 列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示，具体如下：
[0031] 正向引物：5，-ATGTGGGCAAGGTAAAACTC-3，，
[0032] 反向引物：5，-GGTGATGATGATCCATAAAGC-3，。
[0033](二)PCR 扩增条件：
[0034] 总体积为25μ1的PCR反应体系中加入DNA模板2yl、2XPCR反应混合物12.5μ1、2πιΜ dNTP混合物5μ1、10mM引物前后各0.75μ1、K0D酶0.5U、双蒸水3.5μ1，PCR反应条件为：95°C 预变性5min;94°C变性30s，62°C退火45s，72°C延伸lmin，共35个循环;最后72°C延伸7min，4 °C保存。
[0035](三）寻找分子标记：
[0036]优选的，具体实验步骤如下：
[0037] 1、选取国外品种白来航鸡2只和地方品种北京油鸡2只的血液DNA做模板，进行PCR 扩增，PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，图1是鸡tvb基因上的DNA片段PCR 扩增后的电泳结果图，其中，泳道LI、L2代表2只白来航鸡tvb基因 PCR扩增片段，泳道Yl、Y2 代表2只北京油鸡tvb基因 PCR扩增片段，Μ为分子量标准。
[0038] 2、PCR产物的纯化:在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶， 放入1 · 5mL Eppendorf管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公