has-miR-29b-3p的检测的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及快速检测指标技术领域，特别涉及一种检测 microRNA has-miR-29b_3p的试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002] 血流感染是感染性疾病最严重的临床表现形式之一，患者发生血流感染，会导致 住院时间的延长以及住院费用的增加，且病死率高。血流感染的诊断传统通过血培养来鉴 定，但具有需要的血样量多和出报告的时间长等缺点。
[0003] 人体的巨噬细胞具有通过识别、吞噬并最终清除细菌的作用，在宿主抵御病原菌 感染的过程中发挥巨大作用。has-miR-29b-3p是巨噬细胞在受到细菌感染时会高表达的一 种mi croRNA，并且在血培养阳性患者血清中可检测到其较对照组升高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供检测has-miR-29b-3p的试剂盒，建立一种检测has_miR-29b-3p的方法。该方法有快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。
[0005] 为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下：
[0006] -种检测has-miR-29b_3p的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性扩 增has-miR-29b-3p的特异性引物对，所述引物为具有SEQ ID No:l的连续核苷酸序列和具 有SEQ ID No:2的连续核苷酸序列；
[0007] 所述试剂盒中还包括RNA逆转录引物，其序列为SEQ ID No:3。
[0008] SEQ ID No:l:5'GGGTAGCACCATTTGAAA 3'
[0009] SEQ ID No:2:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3'
[0010] SEQ ID No :3如下所示：
[0011] 5 ' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAACACTG3 '
[0012] 优选的技术方案是：所述试剂盒还包括与引物序列构成PCR反应体系的Pfu缓冲 液、dNTPs、MgS04、Pfu DNA聚合酶、模板DNA、焚光染料;所述PCR反应体系的终浓度组成为：
[0013]
[0014]优选的技术方案是：所述荧光染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、 LCGreen?PLUS染料、ResoLight染料、SYT0 9染料、SYBR green染料;所述dNTP混合液包 括lOmM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液。
[0015]本发明的第二方面是提供一种前述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0016] ⑴血清总RNA的提取：包括取血样离心后，取上清，加入TRIzol LS Reagent试剂 和冰醋酸，剧烈振荡混匀进行匀浆;孵育后加入氯仿抽提，取水相加入异丙醇沉淀RNA，离心 沉淀RNA，去除上清液后加入乙醇清洗沉淀RNA，最后空气干燥，加入无 RNA酶的水溶解RNA备 用；
[0017] (2)逆转录:在SEQ ID No:3的反转录酶的作用下及RNA酶抑制剂存在的条件下反 应，反应条件16￡€3〇11^11，42 1€4〇1^11，851€51^11，最后在冰上待用或-20°(：保存；
[0018] (3)荧光定量PCR(RT-PCR):使用SEQ ID N〇:l的引物和SEQ ID N〇:2的引物进行荧 光定量PCR反应，
[0019] (4)建立标准曲线，按绝对定量方法对结果进行分析。
[0020] 在本发明中，术语"试剂盒"是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲液 (buf f er)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl2、Pfu DNA聚合酶。
[0021] 在本发明中，术语"引物"是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的 引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂（即DNA聚合酶或逆转 录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡 脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15~25个核苷酸 之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物 不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。
[0022] 本发明的采用实时荧光定量PCR检测患者血清标本中has-miR-29b-3p表达水平， 从而快速筛查血流细菌感染患者。
[0023] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0024] 本发明首次揭示了 has-miR-29b_3p在血流细菌感染患者血清中升高，可作为快速 筛查血流细菌感染情况的指标。本发明所需血液样本量少，检测周期短(仅数小时）。既可减 轻患者痛楚，也有利于医生早期干预血流细菌感染。
【附图说明】
[0025] 图1为细菌感染后，实时荧光定量PCR检测巨噬细胞has-miR-29b_3p表达结果图。
[0026] 图2实时荧光定量PCR检测健康成年人和患者血清has-miR-29b-3p表达结果图。
【具体实施方式】
[0027] 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用要求的条 件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0028]材料和仪器
[0029] TRIzol LS Reagent试剂、冰醋酸、RNA酶抑制剂均购自Takara公司；
[0030] 实时荧光定量RT-PCR仪-PE公司（美国）。
[0031 ] 实施例1
[0032] 1血清总RNA提取
[0033] 1.1 匀浆
[0034] 血浆样品于4°C 12，000 X g离心10分钟，去除可能存在的杂质，取250ul血浆液体， 转至1.5ml的离心管中，750μ1的TRIzol LS Reagent试剂和20μ1冰醋酸，手动剧烈振荡管体 至混匀。
[0035] 1.2两相分离
[0036]匀浆后样品于15到30°C孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每750μ1的 TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15 秒后，15到30°C孵育2到3分钟。4°C下12,000Xg离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的 红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使 匀浆时加入的TRIzol LS Reagent的60%。
[0037] 1.3 RNA沉淀
[0038] 将水相转移到新离心管中，并加入500μ1异丙醇，混匀以沉淀其中的RNA。混匀后15 到30°C孵育10分钟后，于4°C 12,000\8离心1