一种同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种非疾病诊断目的同时检测异育银 鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法。
【背景技术】
[0002] 粘孢子虫(Myxosporeans)是一类世界分布的后生动物寄生虫，属于粘体动物门， 除少数种类寄生于两栖类、爬行类、鸟类，甚至哺乳类外，大部分寄生于鱼类，其中部分种类 能导致养殖鱼类重大病害的发生，造成严重的经济损失与生态污染。异育银鲫是我国重要 的淡水经济养殖鱼类，近年来，随着新品系的成功培育及养殖技术的推广，其养殖规模不断 扩大，但随之而来的病害也日趋严重，病害问题已成为制约异育银鲫产业健康发展的瓶颈 因素。
[0003] 洪湖碘泡虫、武汉单极虫、吴李碘泡虫、丑陋圆形碘泡虫是危害异育银鲫养殖最为 严重的粘孢子虫。洪湖碘泡虫(Myxobolus honhuensis)是异育银鲫"喉孢子虫病"病原体， 主要危害异育银鲫的苗种培育，其靶组织为鱼体咽部，病害爆发后在咽部形成肉眼可见的 孢囊，鱼体主要症状为不食、游动迟缓、咽部肿胀、鳃盖外翻、眼球外凸、出血等，每年5-10月 为流行季节，5-7月为病害高发期，感染率可达60%，最高死亡率可达100%;武汉单极虫 (Thelohanellus wuhanensis)是异育银鲫"肤孢子虫病"病原体，主要危害异育银鲫的苗种 培育，能与洪湖碘泡虫同期感染，其靶组织为鱼体体表，在体表形成肉眼可见的小孢囊，使 鱼体消瘦，畸形，生长缓慢，甚至大规模死亡，对苗种培育造成巨大的经济损失;吴李碘泡虫 (M.wulii)是"腹孢子虫病"病原体，主要寄生于鱼体的肝胰脏，形成肉眼可见的大孢囊，患 病鱼表现为腹部膨大，内脏萎缩，肝胰脏组织结构被严重破坏，甚至被孢囊完全代替，最终 导致鱼体的死亡;丑陋圆形碘泡虫(M. turpisrotundus)主要寄生于异育银鲫的鲍盖、鲍弓、 口腔内外、鳍条等多个器官组织内，形成大小不一的肉眼可见孢囊，患病鱼死亡率不高，但 严重影响商品鱼的经济价值。
[0004] 粘孢子虫具有复杂的生活史，研究表明粘孢子虫在鱼体中的发育一般要经过营养 体和成熟孢子(孢囊)阶段。在我国，粘孢子虫病的检测主要以显微镜下可见成熟孢子、肉眼 可见孢囊为依据，而一旦粘孢子虫在鱼体内形成成熟的孢子或孢囊，没有任何有效药物能 够渗入成熟孢子坚硬的几丁质外壳。因此，有必要建立一种简单快速的早期检测方法，在粘 孢子虫的营养体阶段进行药物防治，有效地防控粘孢子虫病的病害。
[0005] 在粘孢子虫的检测方面，以显微镜观察成熟孢子为基础的形态学检测方法，虽然 操作简便，但存在检测滞后、费时费力、效率低、易于漏检等问题；以抗原与抗体反应为基础 的免疫学检测方法，虽然具有灵敏性高、能进行早期检测的特点，但由于粘孢子虫生活史中 存在期、属特异性抗原以及共同抗原，交叉反应严重，增加了种特异性检测的难度；以PCR技 术为基础的分子生物学检测方法具有较高的特异性与灵敏性，已经被广泛运用于寄生虫的 早期检测中。
[0006] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加 入多对特异性引物，针对多个模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术，可 用于同时检测多种病原体。该方法不仅能早期检测，灵敏性高，特异性强，而且同普通PCR方 法相比具有省时省力、简单快速等优点。目前，国内外尚无同时对异育银鲫寄生的多种粘孢 子虫进行早期检测的报道。
【发明内容】
[0007] 鉴于异育银鲫寄生粘孢子虫早期检测方法的缺乏，本发明提供一种同时检测四种 寄生于异育银鲫的粘孢子虫的PCR方法，该方法灵敏性高，特异性强，操作简单，有利于异育 银鲫的养殖，能够产生显著的经济效益。
[0008] 上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0009] -种非疾病诊断目的同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法，包括以下 步骤：
[0010] (l)DNA提取:剪取异育银鲫皮肤、鳃、咽及肝胰脏四个部位的部分组织，混合后置 于研钵中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后提取组织样品DNA;
[0011] (1)特异性DNA片段扩增：分别以丑陋圆形碘泡虫的18S rRNA、吴李碘泡虫与洪湖 碘泡虫的ITS1-5.8S-ITS2、武汉单极虫的28S rRNA基因为分子靶标，各设计一对特异性引 物，分别命名为Mtl8S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R;将四对引物置于单个PCR反 应体系中，同时扩增四种粘孢子虫的特异性基因片段；
[0012] (3)琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR扩增产物的片段大小进行结果判定，其中：扩增 出894bp条带的是丑陋圆形碘泡虫，590bp的是吴李碘泡虫，447bp的是洪湖碘泡虫，245bp的 是武汉单极虫，
[0013]所述的四对特异性引物序列分别为：
[0014] Mtl8S F:5'-ACCAGATATTTCGAGGAGTCGTTG-3'
[0015] Mtl8S R:5'-TTCCACAACGTTGCTATATAGCCA-3'
[0016] MwITS F:5'-GCCGTACATGAATTGAGGCTTGAC-3'
[0017] MwITS R:5'-TGCTCACAACGTTAACTCGAACC-3'
[0018] MhITS F:5'-ACGACCAATATATGAAATTGTTTCTCGA-3'
[0019] MhITS R:5'-TTCATTCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3'
[0020] Tw28S F:5'-TTTGTAAAATTCTTAACGCTGGCTAA-3'
[0021] Tw28S R:5 '-TCGAAACGCCAAAACTACGTCA-3 '。
[0022] 优选地，步骤(2)中的PCR反应体系为：
[0023] DNA扩增模板2yL、10XPCR Buffer 2.5yL、25mM Mg2+3.0yL、2.5mM dNTPs4yL、5UAi L TaqDNA聚合酶0.2yL，Mtl8S F/R各0.8yL、MwITS F/R各0.4yL、MhITS F/R各0.6yL、Tw28S F/R各0.4yL，灭菌 ddH20补足至 25yL。
[0024] 优选地，步骤（2)中的PCR反应条件为：95°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火 30s，72°C 延伸 7〇8,35个循环；72°(：延伸71^11，4°(：保存。
[0025] 本发明的有益效果在于：
[0026] 本发明以粘孢子虫的183以祖、1了31-5.83-1了32及283冰熟基因为分子靶标，具 有较高的特异性与灵敏性，三种分子靶标各具特点，其中18S rRNA基因序列长度适中、信息 充足，运用最为广泛；28S rRNA基因片段长，包含相对较多的变量，适合用于不同阶元的分 析研究；ITS属于非编码序列，中间被5.8S rRNA基因分开，进化速度快，具有可变性，尤其适 用于同属近缘物种的区别和鉴定。
[0027]本发明方法特异性强，灵敏性高，可以检测粘孢子虫的早期阶段；同时，与普通PCR 检测方法相比，能够在单个PCR管中进行一次反应检测丑陋圆形碘泡虫、吴李碘泡虫、洪湖 碘泡虫与武汉单极虫，省时省力，具有较大的经济效益。
【附图说明】
[0028]图1:四对引物平衡浓度的实验结果。图中的电泳带分别为:M:Marker DL2000; 1 -12分别代表反应体系中四对引物的添加浓度：1:0.8、0.8、0.4、0.4μΜ2:0.8、0.4、0.6、0.4μ L;3:0.8、0.4、0.4、0.6yL;4:0.6、0.8、0.4、0.4yL ;5:0.4、0.8、0.6、0.4yL;6:0.4、0.8、0.4、 0.6yL;7:0.6、0.4、0.8、0.4yL;8:0.4、0.6、0.8、0.4yL ;9:0.4、0.4、0.8、0.6yL;10:0.6、0.4、 0.4、0.841^11:0.4、0.6、0.4、0.841^12:0.4、0.4、0.6、0.84以各引物工作浓度均为1(^]\1 ;每 组从左至右分别为:Mtl8S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R);l-12均以四种粘孢子 虫混合DNA为模板。
[0029]图2 : Mg2 +、dNTP、TaqDNA聚合酶平衡浓度的实验结果。图中的电泳带分别为：Μ: Marker DL2000; 1:2.0、2.0、0.2yL;2:3.0、2·0、0·3μΜ3:4·0、2·0、0·4μΜ4:2·0、3·0、0·3μ L;5:3.0、3.0、0.4uL;6:4·0、3·0、0·2uL;7:2·0、4·0、0·4uL;8:3·0、4·0、0·2uL;9:4·0、4·0、 0·3μLΧ 每组从左至右分别是 Mg2+(25mM)、dNTPs(2.5mM)、TaqDNA 聚合酶（5UAiL));l-9 均以四 种粘孢子虫混合DNA为模板。
[0030] 图3:不同反应退火温度的实验结果。图中的电泳带分别为:M:Marker DL2000;l-6 分别代表反应退火温度为55、56、57、58、59、60 °C ; 7:空白对照。
[0031]图4:四重PCR特异性实验结果。a:丑陋圆形碘泡虫;b:吴李碘泡虫;c:洪湖碘泡虫； d:武汉单极虫。图中的电泳带分别为:M: Marker DL2000 ;l:a，b，c，d;2:a，b，c;3:a，b，d;4: 13，(：，(1;5:&，13;6:&，(3;7:&，(1;8:13，(3;9:13，(1;10:(3，(1混合0祖；11:&;12:13;13:(3;14:(