0分钟。此时离心前不可见的1?^沉淀将在管 底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
[0039] 1.4 RNA清洗
[0040] 移去上清液，750μ1的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入至少lml的75% 乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4°C 7，500 X g离心5分钟。
[0041 ] 1 · 5重新溶解RNA沉淀
[0042] 去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，溶解RNA时，先加入无 RNA酶的水用 枪反复吹打几次，然后55到60°C孵育10分钟。获得的RNA溶液即可用于后续实验。
[0043] 2逆转录
[0044] 2.1逆转录引物
[0045] 5 ' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAACACTG3 '
[0046] 2.2反应体系：
[0047] dNTP(2.5mM each) 2ul
[0048] 1 OX RT Buffer 2ul
[0049] RT 特异引物（luM) 0.3ul
[0050] Total RNA800ng
[0051] MMLV 反转录酶（200U/ul) 0.2ul
[0052] RNA 酶抑制剂(40u/ul) 0.3ul
[0053] 无 RNA酶水 upto 20ul
[0054] 总体积 20ul
[0055] 2.3反应条件：
[0056]
[0057] 反应结束后，将其放在冰上待用或-20°C保存。
[0058] 3实时荧光定量PCR(RT-PCR)
[0059] 3 · 1 引物:F: 5 ' GGGTAGCACCATTTGAAA 3 ' ；
[0060] R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3，
[0061] 3.2体系配置如下：
[0062] 2XMaster Mix 5μ1
[0063] 10uM 的 PCR 特异引物F 0.5μ1
[0064] 10uM 的 PCR 特异引物R 0.5μ1
[0065] 加水至总体积为 8μ1
[0066] 3.3加样
[0067] a.将8ul混合液加到RT-PCR板对应的每个孔中。
[0068] b.再加入对应的2μ1 cDNA。
[0069] c.小心粘上封□膜，并短暂离心混合。
[0070] c.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
[0071] 3.4将上述RT-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
[0072]反应条件：
[0073] 95°C，10min;40个PCR循环(95°C，10秒;60°C，60秒(收集荧光））。
[0074]为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95°C，10秒;60°C，60秒;95°C， 15秒）；并从60°C缓慢加热到99°C (仪器自动进行-Ramp Rate为0.05°C/秒）。
[0075] 3.5结果计算方法
[0076]建立标准曲线，按绝对定量方法对结果进行分析。
[0077]实时荧光PCR采用的荧光染料为SYBR green，它是一种DNA双链结合染料，当它与 DNA双链结合时发出荧光，其信号强度代表了DNA双链分子的数量。除了需要在体系中加入 荧光染料外，实时荧光定量PCR反应体系与高保真酶介导的普通PCR完全相同。
[0078]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明 的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和 改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同 物界定。
【主权项】
1. 一种检测has-miR-29b-3p的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性扩增 has-miR-29b-3p的特异性引物对，所述引物为具有SEQ ID No:l的连续核巧酸序列和具有 SEQ ID No:2的连续核巧酸序列； 所述试剂盒中还包括RNA逆转录引物，其序列为SEQ ID No:3。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括与引物序列构成PCR 反应体系的P化缓冲液、dNTPs、MgS化、P化DNA聚合酶、模板DNA、巧光染料;所述PCR反应体 系的终浓度组成为： Pfu缓冲液 终浓度1~5X; dNTPs 引物序列 终浓度为0.1~0.5μΜ; 模板DMA 〇.03~1，5叫/|止； Pfu DNA 聚含釀 0.01 ~O.lOU/yL; 焚光染料 1~2X。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述巧光染料可选自DNA饱和性染料包 括EvaGreen染料、LCGreell礙PLUS染料、ResoLight染料、SYT0 9染料、SYBR green染料;所 述dNTP混合液包括lOmM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液。4. 一种权利要求1所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤： (1) 血清总RNA的提取:包括取血样离屯、后，取上清，加入TRIzol LS Reagent试剂和冰 醋酸，剧烈振荡混匀进行匀浆;解育后加入氯仿抽提，取水相加入异丙醇沉淀RNA，离屯、沉淀 RNA，去除上清液后加入乙醇清洗沉淀RNA，最后空气干燥，加入无 RNA酶的水溶解RNA备用； (2) 逆转录:在SEQ ID No:3的反转录酶的作用下及RNA酶抑制剂存在的条件下反应，反 应条件 161：3〇111111，421：4〇111111，851：5111111，最后在冰上待用或-20°(：保存； (3) 巧光定量PCR(RT-PCR):使用SEQ ID No:l的引物和SEQ ID No:2的引物进行巧光定 量PCR反应， (4) 建立标准曲线，按绝对定量方法对结果进行分析。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，本发明公开了一种检测has-miR-29b-3p的试剂盒及其方法，试剂盒包括用于特异性扩增has-miR-29b-3p的特异性引物对，所述引物为具有SEQ？ID？No：1的连续核苷酸序列和具有SEQ？ID？No：2的连续核苷酸序列；所述试剂盒中还包括RNA逆转录引物，其序列为SEQ？ID？No：3。本发明首次揭示了has-miR-29b-3p在血流细菌感染患者血清中升高，可快速筛查血流细菌感染情况。本发明所需血液样本量少，检测周期短；既可减轻患者痛楚，也有利于医生早期干预血流细菌感染。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105567826
【申请号】CN201610048023
【发明人】杜鸿, 王敏, 张海方, 谢小芳, 李爱青, 周惠琴
【申请人】苏州大学附属第二医院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月25日