。
[0110] 在对四异戊二烯-β_姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸中包含，具有在用序列编 号19~21表示的各碱基序列中置换、缺失、插入或添加1个或多个碱基的碱基序列，并且对 保持由3-脱氧蓍醇Α生成龙涎香醇的功能的多肽进行编码的多核苷酸。用序列编号19~21 表示的各碱基序列中置换、缺失、插入或添加的碱基的数量，具体地优选为1~20个，更优选 为1~10个，进一步地优选为1~5个。
[0111] 在对四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸中包含，相对于用序列编 号19~21表示的各碱基序列整体，具有例如80%以上，优选为90%以上，更优选为95%以 上，更优选为97%以上，更优选为98%以上，特别地优选为99%以上的序列同一性，并且对 保持由3-脱氧蓍醇Α生成龙涎香醇的功能的多肽进行编码的多核苷酸。
[0112] 在对四异戊二烯-β_姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸中，包含相对于用序列编 号19~21表示的各碱基序列的各互补链，在严格的条件下进行杂交的、对保持由3-脱氧蓍 醇Α生成龙涎香醇的功能的多肽进行编码的多核苷酸。杂交的条件以及严格的条件与对突 变型角鲨烯-藿烯环化酶描述的条件相同。
[0113]作为四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，例如，可举例用序列编号19~21中的任意一者 表示的碱基序列编码的多肽，可举例用序列编号19或序列编号20表示的碱基序列编码的多 肽，可举例用序列编号19表示的碱基序列编码的多肽。
[0114]作为为了表达对四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸而使用的重组 载体，没有特别的限制，可举例pColdTF等能用大肠杆菌表达的载体、pHTOl等能用枯草杆菌 表达的载体、PYES2等能用酵母表达的载体等。通过将对四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶进行 编码的多核苷酸导入至这些载体中，能得到酶表达用载体。作为酶表达用载体的导入对象 的宿主细菌，能根据使用重组载体的种类适宜地选定，例如，可举例BL21 (DE3)等大肠杆菌、 168株等枯草杆菌、酿酒酵母等的酵母等。
[0115]根据需要，重组载体与可以具有启动子、剪接信号、聚A(polyA)添加信号、选择性 标记、核糖体结合序列(SD序列）、N0S等终止子等。作为选择性标记，使用例如卡那霉素抗性 基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因等抗生素抗性基因等公知的物质，没有特别的 限制。
[0116] 重组载体也可以含有用于确认作为目的的基因的导入的报告基因。作为这样的报 告基因，可举例GUS(i3_葡萄糖醛酸酶）、荧光素酶基因、GFP(绿色荧光蛋白质)基因等。
[0117] 四异戊二烯-β_姜黄烯环化酶通过对将酶表达用载体导入至细菌等中所得的转化 体进行培养而生成。用于转化体的培养的培养基可以是通常使用的培养基，根据宿主的种 类适宜地选择。例如，在培养大肠杆菌的情况中，使用LB培养基等。在培养基中，也可以添加 相应于选择性标记的种类的抗生素。
[0118] 四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，也可以是从通过培养能表达所述酶的转化体所得 的培养液中将酶萃取提纯的物质。而且，也可以直接使用含有从培养液中的转化体中萃取 的酶的萃取液。对于从转化体中萃取酶的方法而言，可以使用公知的方法。酶的萃取工序可 以含有，例如，在萃取溶剂中破碎转化体，并将细胞内容纳的物质与转化体的破碎碎片分离 的工序。在所得的细胞内容纳的物质中，含有作为目的的四异戊二烯-β_姜黄烯环化酶。
[0119] 作为转化体的破碎方法，可以使用将转化体破碎、并能回收酶溶液的公知的方法， 例如，可举例超声波破碎、玻璃珠破碎等。对于破碎的条件没有特别的限制，只要是l〇°C以 下以及15分钟等酶不失活的条件即可。
[0120] 作为细胞内容纳的物质与微生物体的破碎碎片的分离方法，可举例沉淀分离、离 心分离、过滤分离以及这些的2种以上的分离方法的组合等。使用这些方法的分离条件对本 领域的技术人员而言是公知的，在离心分离的情况中，例如，为8000 Xg~15000 Xg以及10 分钟~20分钟。
[0121] 作为萃取溶剂，可以是作为酶的萃取溶剂通常使用的溶剂，例如，可举例Tris-HCl 缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷-HC1缓冲液）、磷酸钾缓冲溶液等。萃取溶剂的pH在酶的稳定 性这一点上，优选为3~10,更优选为6~8。
[0122] 在萃取溶剂中，也可以含有界面活性剂，作为界面活性剂，可举例非离子界面活性 剂、两性离子界面活性剂等。作为非离子型界面活性剂，可举例聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸 酯(Tween 80)等聚氧乙烯脱水山梨醇单脂肪酸酯、η-辛基β-D-葡萄糖苷等烷基葡萄糖苷、 蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯等聚甘油脂肪酸酯等。作为两性离子界面 活性剂，可举例作为烷基甜菜碱的Ν，Ν-二甲基-Ν-十二烷基甘氨酸甜菜碱等。除此以外，也 能使用曲拉通X_l〇〇(Triton Χ-100)、聚氧乙烯(20)十六烷基醚(Brij-58)、壬基酚聚氧乙 稀醚(Terg i to 1 NP-40)等本技术领域中通常使用的界面活性剂。
[0123] 从酶的稳定性的观点出发，萃取溶剂中的界面活性剂的浓度，优选为0.001质量％ ~10质量％，更优选为0.10质量％~3.0质量％，进一步地优选为0.10质量~1.0质量％。
[0124] 从酶活性的观点出发，在萃取溶剂中，优选含有二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等还原 剂。作为还原剂，优选为二硫苏糖醇。萃取溶剂中的二硫苏糖醇的浓度优选为0.1 mM~1Μ，更 优选为ImM~1 OmM。通过在萃取溶剂中存在二硫苏糖醇，在酶中的二硫键等结构的保持变得 容易，酶活性有相对上升的倾向。
[0125] 从酶活性的观点出发，在萃取溶剂中，优选含有乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂。萃 取溶剂的EDTA的浓度优选为O.OlmM~1M，更优选为O.lmM~10mM。通过在萃取溶剂中存在 Η)ΤΑ，由于降低酶活性的金属离子被螯合，酶活性有相对上升的倾向。
[0126] 在萃取溶剂中，除了上述成分以外，也可以含有能在酶萃取溶剂中添加的公知的 成分。
[0127] 四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶既可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0128] 四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇Α反应的条件只要是能进行酶反应的 条件，则没有特别的限制。例如，能基于四异戊二烯-β_姜黄烯环化酶的活性等适宜地选择 反应温度以及反应时间。从反应效率的观点出发，优选反应温度以及反应时间为，例如，4°C ~l〇〇°C以及0.1小时~48小时，优选为30°C~60°C以及16小时~24小时。从反应效率的观 点出发，pH条件为，例如3~10，优选为6~8。
[0129] 反应溶剂如果是不抑制酶反应的物质，则没有特别地限制，能使用通常使用的缓 冲溶液等。而且，例如，能使用与在酶的萃取工序中使用的萃取溶剂相同的溶剂。而且，也可 以将含有四异戊二烯-β_姜黄烯环化酶的萃取液(例如，无细胞萃取液)作为酶溶液直接用 于反应中。
[0130] 从反应效率的观点出发，龙涎香醇生成反应中的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与 其底物3-脱氧蓍醇Α的浓度比作为，作为相对于酶的底物的摩尔浓度比（底物/酶），优选为 10~10000,更优选为100~5000,更优选为1000~3000,进一步优选为1000~2000。
[0131]从反应效率的观点出发，相对于反应溶剂的总质量，用于酶反应的3-脱氧蓍醇A的 浓度，优选为〇. 000001质量％~〇. 002质量％，更优选为0.00001质量％~0.0002质量％。 [0132]四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应的反应工序也可以重复进行数 次。由此，能提高龙涎香醇的收率。在重复进行数次反应工序的情况中，也可以包含:将成为 底物的3-脱氧蓍醇A再投入至反应系中的工序、在通过公知的方法使酶失活后对反应液中 的反应生成物进行回收以及提纯的工序等。在进行3-脱氧蓍醇A的再投入的情况中，可以根 据反应液中的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的浓度、反应液中残存的底物的量等，适宜地设 定投入时期、投入量。
[0133] 在含有3-脱氧蓍醇Α生成工序和龙涎香醇生成工序的情况下，从龙涎香醇的生成 效率以及制造方法的简便性的观点出发，本发明的龙涎香醇的制造方法，优选为使通过来 自脂环酸芽孢杆菌属细菌的突变型角鲨烯-藿烯环化酶和角鲨烯的反应所得的3-脱氧蓍醇 A与来自芽孢杆菌属细菌的四异戊二烯-β_姜黄烯环化酶反应生成龙涎香醇的方法。更优选 为，使通过来自酸热脂环酸芽孢杆菌的突变型角鲨烯-藿烯环化酶和角鲨烯的反应所得的 3_脱氧蓍醇Α与来自巨大芽孢杆菌或者枯草芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶反应 生成龙涎香醇的方法。
[0134] [其他的工序]
[0135] 本发明的龙涎香醇的制造方法也可以进一步包含对生成的龙涎香醇进行提纯的 提纯工序。作为龙涎香醇的提纯方法，只要能提取出反应液中的龙涎香醇，则没有特别地限 制，可以从通常使用的提纯方法中适宜地选择。作为提纯方法，具体地，可举例溶剂萃取、再 结