用于预防和治疗用途的作为免疫刺激剂的基于球形核酸的构建体的制作方法
【专利说明】用于预防和治疗用途的作为免疫刺激剂的基于球形核酸的构 建体
[0001 ] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年7月25日提交的题为"作为用于预防和治 疗用途的免疫刺激剂的基于球形核酸的构建体"的美国临时申请号61/858,558的优先权， 通过引用将其全文并入本文中。 发明领域
[0003] 本发明涉及核酸相互作用复合物的激动剂例如TLR的激动剂的纳米级构建体及其 方法和组合物。
[0004] 发明背景
[0005] 免疫系统是高度发展，非常精确的内源性机制，其用于清除包括病原体和衰老或 恶性宿主细胞的异质的、有害的和不必要的物质。已知的是，可以通过引入调节特异性免疫 细胞的活性的化合物，实现调节用于治疗或预防目的的免疫系统。一个主要的例子是疫苗， 其已显示诱导针对病原体以及癌细胞的保护的能力。第一个现代疫苗制剂包括活/减毒或 灭活的病原体，但在许多情况下这些疫苗制剂被认为毒性太大，或没有提供保护性免疫。纯 化的蛋白衍生物和其它抗原亚单位疫苗的策略被一直研究，但这些通常导致轻度保护性或 低效率的响应。现在所理解的是，在大多数情况下，公知有效免疫需要使用免疫刺激化合 物，除其他事项外，免疫刺激化合物提供必要的信号，以诱导更加稳健的，特异性和长时间 的应答，包括细胞介导的免疫和免疫记忆。这些应答的性质可以通过引入的免疫刺激性一 个或多个化合物的类型来调节。实际上，已经假定，在适当的抗原刺激的存在下一起施用的 免疫刺激性化合物可用于诱发多种免疫应答，这具有治疗或预防各种疾病，包括感染性疾 病和癌症的可能性。这些也可能会被用于接种免疫功能低下的人群，如儿童和老人。 1
[0006] 在各种具有关键全世界影响的，包括艾滋病(AIDS)，疟疾，衣原体，各种恶性肿瘤 和变态反应或变应性疾病，如哮喘的疾病中，现有疫苗不能诱导有效的免疫应答。在处于开 发中的免疫刺激化合物中，To 11样受体(TLR)激动剂已经被证明具有优秀潜力。TLR4激动 剂，诸如单磷酰脂质A(MPL)已经达到临床试验的后期和在一些情况中在多个国家中得到批 准。 2尽管有这些令人鼓舞的结果，仍然对可以安全和有效地诱导应答的化合物有明确和显 著的需要，所述应答可以清除细胞内病原体和癌症，例如细胞介导的免疫诱导剂。TLR 3， TLR7/8和TLR 9的激动剂由于其诱导Thl细胞介导的免疫应答的强效能力，具有优异的潜 力。合成TLR 7/8激动剂，咪喹莫特，已经被批准用于治疗各种皮肤疾病，包括表浅性癌和生 殖器疣，并正在针对各种其他适应症而被开发。同样，TLR 9激动剂处于临床开发的各个阶 段，用于治疗各种疾病，所述疾病伴有大量未满足的医疗需求。然而，由于缺乏疗效，脱靶硫 代磷酸酯的影响和毒性问题减缓TLR 7/8和9激动剂的有效的临床平移。
[0007] 发明概述
[0008] 本文中所述的是，用于使用纳米级构建体、增强免疫应答并活化核酸相互作用的 复合物(诸如TLR)的新方法和组合物。本发明的方面涉及纳米级构建体，其具有核酸相互作 用复合物的激动剂的冠部，其中核酸相互作用复合物的激动剂的表面密度为至少〇.3pmol/ cm2。
[0009] 在其他方面，本发明是构建体，其具有核酸相互作用复合物的拮抗剂的冠部，以及 被并入冠部的抗原。在一些实施方案中，抗原的表面密度为至少〇.3pmol/cm 2。在其他实施 方案中，抗原包括至少两种不同类型的抗原。
[0010] 在又一些其他方面，本发明是构建体，其具有并入了核酸相互作用复合物的至少 两种激动剂的冠部，其中激动剂选自由TLR 3、7/8和/或9的激动剂组成的组。
[0011] 在一些实施方案中，核酸相互作用复合物的激动剂含有间隔子。
[0012] 在其他实施方案中，核酸相互作用复合物的激动剂是RNA或DNA。核酸相互作用复 合物的激动剂可以是例如双链RNA，如聚（I:C)。备选地，核酸相互作用复合物的激动剂可以 是单链RNA，如含UUG-基序的RNA。在一些实施方案中，核酸相互作用复合物的激动剂为未甲 基化的脱氧核糖核酸，诸如CpG寡核苷酸。
[0013] 在某些实施方案中，纳米级构建体包括在冠部中心的纳米颗粒核心并且任选地纳 米颗粒核心是金属的。金属核心选自由金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物组成的 组。在某些实施方案中，纳米颗粒核心包含金。在其他实施方案中，纳米级构建体是可降解 的。
[0014] 在某些实施方案中，纳米级构建体的直径是平均直径lnm至大约250nm、平均直径 大约lnm至大约240nm、平均直径大约lnm至大约230nm、平均直径大约lnm至大约220nm、平均 直径大约lnm至大约210nm、平均直径大约lnm至大约200nm、平均直径大约lnm至大约190nm、 平均直径大约lnm至大约180nm、平均直径大约lnm至大约170nm、平均直径大约lnm至大约 160nm、平均直径大约lnm至大约150nm、平均直径大约lnm至大约140nm、平均直径大约lnm至 大约130nm、平均直径大约lnm至大约120nm、平均直径大约lnm至大约llOnm、平均直径大约 lnm至大约lOOnm、平均直径大约lnm至大约90nm、平均直径大约lnm至大约80nm、平均直径大 约lnm至大约70nm、平均直径大约lnm至大约60nm、平均直径大约lnm至大约50nm、平均直径 大约lnm至大约40nm、平均直径大约lnm至大约30nm或者平均直径大约lnm至大约20nm或者 平均直径大约lnm至大约10nm。
[0015]在其他方面，本发明是纳米级构建体，其具有核酸相互作用复合物的激动剂的冠 部，其中激动剂是具有至少一个核苷酸间磷酸二酯键的核酸。在一些实施方案中，所述激动 剂是CpG寡核苷酸。在其它实施方案中，核酸的每个核苷酸间键是磷酸二酯键。
[0016] 在本发明的实施方案中，冠部是球形冠部。
[0017] 根据本发明的其他方面，提供了由如本文中所述的纳米级构建体和载体组成的疫 苗。
[0018] 在其他方面中提供了用于向细胞递送治疗剂的方法，其包括向细胞递送本发明的 纳米级构建体。
[0019] 在本发明的其他方面中提供了用于调控靶分子的表达的方法。该方法涉及向细胞 递送本发明的纳米级构建体。在一些实施方案中，靶分子是选自由TLR3、7、8和9组成的组的 TLR〇
[0020] 在本发明的其他方面中提供了用于活化TLR的方法，其通过向细胞递送如本文中 所述的纳米级构建体。
[0021] 根据其他方面，本发明是治疗受试者的方法，其涉及向受试者施用有效量的如本 文中所述的纳米级构建体以刺激免疫应答。在一些实施方案中，受试者患有感染性疾病、癌 症、自身免疫性疾病、变态反应或变应性疾病，如哮喘。
[0022] 在依然其他实施方案中，本发明是诱导受试者中免疫应答的方法，其通过向受试 者施用有效量的核酸相互作用复合物的激动剂的冠部的纳米级构建体以刺激免疫应答，其 中所述激动剂是具有至少一个核苷酸间磷酸二酯键的核酸。
[0023] 在某些实施方案中，该方法涉及向细胞递送治疗或检测形式(modality)。
[0024] 本发明进一步的方面涉及试剂盒，其包含:纳米级构建体，其任选包括纳米颗粒核 心;并且具有核酸相互作用复合物的激动剂和用于组装核酸相互作用复合物的激动剂-冠 部的说明。在某些实施方案中，该试剂盒进一步包含使用说明。
[0025] 本发明的每个限制可以涵盖本发明的各种实施方案。因此，预计涉及任一种元素 或元素的组合的本发明的每个限制可以被包括于本发明的每个方面。本发明不限于所应用 的以下说明中所列出的或附图中所示的成分的构建和排列的细节。本发明能够具有其他实 施方案并以各种方式进行实践或执行。
【附图说明】
[0026]附图并不旨在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的 成分由相同的标号表示。为了清晰起见，在每幅图中并非每个成分均可被标记。在附图中：
[0027] 图1A-1B显示本发明的纳米级构建体的示意的非限制性实例。A.示出的是佐剂纳 米级构建体的一般结构，所述纳米级构建体具有核心以及与核心结合的一种或多种核酸相 互作用复合物的激动剂，如TLR激动剂。B.示出的是佐剂纳米级构建体的一般结构，所述纳 米级构建体具有核心和与核心结合的一种或多种TLR激动剂和一种或多种抗原。
[0028] 图2是一组曲线图，其描绘本发明纳米级构建体相对于在溶液中的核酸相互作用 复合物(CpG寡核苷酸)的激动剂在巨噬细胞中显著增强的效力。
[0029] 图3是一组曲线图，其描绘在过夜孵育后本发明纳米级构建体相对于在溶液中的 核酸相互作用复合物(CpG寡核苷酸)的激动剂在巨噬细胞中显著增强的效力。
[0030] 图4是一组曲线图，其描绘采用本发明纳米级构建体相对于在溶液中的核酸相互 作用复合物(CpG寡核苷酸）的激动剂的细胞因子分泌增强水平。针对在纳米级构建体和TRL 激动剂组中均具有磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸间键的寡核苷酸，检验了对细胞因子诱导 的影响。
[0031] 图5是线图和柱状图，其描绘响应于刺激的TLR9活化，所述刺激采用具有磷酸二酯 CpG的寡核苷酸的本发明的纳米级构建体，与溶液中的磷酸二酯和硫代磷酸酯CpG寡核苷酸 比较。
[0032] 图6是一组曲线图，其描绘本发明的纳米级构建体相对于几个不同的CpG寡核苷酸 序列在效力中的多倍增加 。CpG 1826是SEQ ID N0:1和它下面的rplV是SEQ ID N0:2<XpG 1668为SEQIDN0:3和其下面的rplV是SEQIDN0:4。
[0033] 图7是一组曲线图，其描绘调节对激动剂活性的增强的纳米级构建体核心大小暗 示的效果。
[0034] 图8示出曲线图，其描绘比CpG寡核苷酸更快速和持续的活化。
[0035] 图9是一组曲线图，其描绘硫代磷酸酯修饰以序列依赖性的方式调节激动剂活性 的能力。对于CpG 1668:P0是SEQ ID N0:5，C*G是SEQ ID N0:6,5PS2/C*G是SEQ ID N0:7,和 PS是SEQIDNO:8。对于CpG 1826:PO是SEQIDNO:9,OG是SEQIDNO:10,5PS2/OG是SEQ ID NO:11，和PS是SEQ ID NO:12。
[0036] 图10是一组曲线图，其描绘寡核苷酸负荷密度影响激动剂活性的能力。
[0037]图11示出曲线图，其描绘CpG Ρ0/Ρ0纳米级构建体的活化的时间过程。在孵育>4小 时前不会活化测试的构建体。
[0038]图12示出曲线图，其表明5'Chol CpG P0纳米级构建体显示在低nM范围的活化，并 且5'C18废除活性。
[0039] 图13是一组曲线图，其表明对于随后的活化，预铺板的巨噬细胞是更主要的。
[0040] 图14是一组曲线图，其表明由巨噬细胞导致低水平的IFN- γ分泌。
[0041 ]图15示出了免疫治疗的SNA (AST-008)的表示。图6示出了，SNAS可以使治疗性疫苗 抗原和佐剂同时存在于单一的纳米颗粒，并可能同时靶向多个免疫刺激受体(例如TLR 3， 4,7/8,9)〇
[0042]图16是一个简图，其表明AST-008如何可以通过触发胞吞作用进入内体，然后AST-008 在内体中可以用于通用的免疫系统刺激。在内体中， AST-008 通过 TLR 9 受体、 SNA 疗法的 分子靶标，刺激免疫系统信号传导，导致先天性和适应性免疫应答。AST-008也可以靶向TLR 3，4 7/8,导致先天和适应性免疫应答。
[0043]图17A和17B是一组曲线图，其示出了，与体外相应的CpG寡脱氧核苷酸(〇1 igo)相 比，AST-008诱导更高的促炎性应答。图17A示出了由CTL oligo，CTL SNA，CpG 1826,和AST-008诱导的TNF，IL-12，和IL-6的表达水平。图17B展示了从所示的试剂所产生的NF-κΒ活化。 [0044]图18表明，单一皮下剂量的施用后，AST-008靶向引流淋巴结。AST-008被银染色以 增强金核心的光散射，然后用曙红复染。使用4X亮视野放大倍率。
[0045]图19是说明A S T - 0 0 8的体内活性的曲线图。小鼠被给予5.1纳摩尔（n m ο 1)溶液 (AST-008-po，AST-008-ps，CpG 1826-po，CpG 1826-ps，GpC-po SNA，GpC-ps SNA，GpC-po， 或GpC-ps)的50yL推注尾静脉(静脉内）注射，然后在注射后1，3和6小时分析IL-12表达(每 组24只小鼠，每个时间点3只）<JL-12水平被表示为相对于PBS的倍数。相对于游离寡聚脱氧 核苷酸，AST-008结构增强IL-12的诱导大约20倍，和初始给药后六小时期间效果得以持续。 [0046] 图20A-20C由一对图形和图表组成，所述图形和图表显示，AST-008诱导平衡的 Thl/Th2应答（图20A)和比明矾或CpG寡核苷酸更高的IgG2a抗体（图20B)的应答。结果被制 表于图 20(λ#ρ〈0·01。
[0047] 图21Α-21Β显示，AST-008比明矾或CpG寡核苷酸更有效地诱导细胞应答。图21Α示 意性地表示方案:使脾细胞生长28天，在第0天与第21天对其进行攻击，然后采用SIINFEKL 进行再刺激和用ELISP0T在第28天探查INF-□。图21B是描绘结果的图。##p〈0.0001。 [0048] 图22A-22B表明，AST-008在体内淋巴瘤模型中诱导显著肿瘤清除免疫应答。图22A 示出方案:C57BL/6小鼠的右侧肋被注射1 X 106E. G7-0VA淋巴瘤(每组11个）。然后采用100 微克(yg)〇VA皮下（s · c ·)，1 ·8微克OVA 257-264皮下和AST-008中的0 ·92纳摩尔(nmol )oligo 对小鼠进行三次攻击，并且以2000立方毫米处死小鼠。图22B是结果的曲线图。*p〈0.05，使 用双因素 AN0VA。
[0049] 图23A-23B显示，与CpG寡脱氧核苷酸相比，AST-008表现出更优异的抗肿瘤活性和 更长的生存。这些图显示，在C57BL/6小鼠在其右侧肋(每组11只）被注射1 X 106E. G7-0VA淋 巴瘤、然后用TOS，PBS和0VA，CpG 1826和0VA，或AST-008和0VA攻击三次后，肿瘤体积（图 23A)和存活百分比（图238)。吨〈0.05。
[0050] 登述
[0051] 本发明不限于所应用的以下说明中所列出的或附图中所示的成分的构建和排列 的细节。本发明能够具有其他实施方案并以各种方式进行实践或执行。此外，本文中使用的 措辞和术语是为了说明的目的，而不应被视为限制。本文中使用"包括"、"包含"或"具有"、 "含有"、"涉及"及其变型是指涵盖其后所列出的项目及其等价物以及其他项目。
[0052] 在一些方面，本发明尤其通过实现更快的活化，产生多价结构，改变细胞分布，并 促进各种佐剂和含有抗原的结构的简单且可扩大规模的合成，克服了常规的TLR 3，TLR 7/ 8,和TLR 9激动剂所遇到的几个主要障碍。本发明的构建体导致用于在治疗多种疾病/感染 中的预防或治疗用途中的更有效的疫苗，所述疾病/感染包括，例如，艾滋病(AIDS)，疟疾， 衣原体，弯曲杆菌，巨细胞病毒，登革热，EB单核细胞增多(Epstein-Barr mononucleosis)， 口蹄疫(foot and mouth disease)，狂犬病，幽门螺杆菌胃溃疡，甲、乙、丙型肝炎，单纯疱 疹，流感，利什曼病，霍乱，白喉，嗜血杆菌流感，脑膜炎球菌性脑膜炎，鼠疫，肺炎球菌性肺 炎，破伤风，伤寒，呼吸道合胞病毒，鼻病毒，血吸虫病，志贺氏菌，A和B族链球菌，结核病，霍 乱弧菌，沙门氏菌，曲霉菌，芽生菌，组织胞浆菌，念珠菌，隐球菌，肺囊虫和泌尿道感染;各 种食物变态反应，如花生，水果，大蒜，燕麦，肉，奶，鱼类，贝类，大豆，坚果，小麦，面筋(谷蛋 白、麸质），蛋，亚硫酸盐;各种药物变态反应，如对以下的变态反应：四环素，苯妥英钠，卡马 西平，青霉素类，头孢菌素类，磺胺类，NSAIDs的，静脉内造影剂，局部麻醉剂；自身免疫疾病 如多发性硬化症，狼疮，炎性肠病，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，哮喘，和慢性阻塞性肺病 (C0PD);和癌症，如黑色素瘤，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，多形性胶 质母细胞瘤等。
[0053] 在示意图1中示出，一组本发明的示例性纳米构建体。在此描述的平台是用于装载 核酸相互作用复合物的一种或多种激动剂(multiple agonist)(A)或核酸相互作用复合物 的一种或多种激动剂和抗原(B)。（ 1)核酸相互作用复合物，如被靶向的TLR(TLR3，7/8，和/ 或9)，（2)核酸相互作用复合物的激动剂的密度，（3)抗原密度，（4)多个抗原呈递，（5)核心 构成，大小和电荷，和(6)核心接头化学"L"，和(7)激动剂化学结构的优化被预计在疫苗开 发中得到新的范例。特别是，核酸相互作用复合物的激动剂包括双链RNA(如聚（I:C