)，TLR 3)，单链RNA(例如含UUG-基序的链，TLR 7/8)和未甲基化的脱氧核糖核酸和衍生物(例如含 CpG基序的链）。
[0054] 本发明的方面涉及纳米级构建体。纳米级构建体是指具有容纳于几何位置中的一 种或多种核酸的纳米大小的构建体。纳米级构建体通常被称为一组核酸的冠部。本文中使 用的冠部是指由核酸分子组成的外壳。冠部可以具有由核酸或其他材料(诸如金属)组成的 纳米颗粒核心。备选地，冠部可以简单地为以具有中空核心的几何形状排列的一组核酸，即 核酸的三维形状的层。通常、但不总是如此，冠部具有球形形状。
[0055] 在该情况下，当冠部包括纳米颗粒核心时，核酸可以被直接连接至该核心。一些或 所有的核酸可以通过共价键或非共价键被直接或间接连接至其他核酸。一种核酸与另一核 酸的键可以是除了该核酸与核心的键之外的键，或者备选地是该核酸与核心的键。核酸的 一种或多种还可以被连接至其他分子(诸如抗原）。
[0056] 当冠部不包括纳米颗粒核心时，核酸可以通过共价键或非共价键被直接或间接互 相连接。在一些实施方案中，可以通过将核酸在晶格或其他可溶解结构上成层（layering) 形成不包括纳米颗粒核心的冠部，然后溶解晶格或其他结构以产生空的中心。
[0057] 本文中使用的纳米级构建体是具有纳米级（即在大约lnm和大约1微米之间）平均 直径(average diameter)的构建体。例如，在一些情况下，纳米级构建体的直径是平均直径 (mean diameter)大约lnm至大约250nm、平均直径大约lnm至大约240nm、平均直径大约lnm 至大约230nm、平均直径大约lnm至大约220nm、平均直径大约lnm至大约210nm、平均直径大 约lnm至大约200nm、平均直径大约lnm至大约190nm、平均直径大约lnm至大约180nm、平均直 径大约lnm至大约170nm、平均直径大约lnm至大约160nm、平均直径大约lnm至大约150nm、平 均直径大约lnm至大约140nm、平均直径大约lnm至大约130nm、平均直径大约lnm至大约 120nm、平均直径大约lnm至大约llOnm、平均直径大约lnm至大约100nm、平均直径大约lnm至 大约90nm、平均直径大约lnm至大约80nm、平均直径大约lnm至大约70nm、平均直径大约lnm 至大约60nm、平均直径大约lnm至大约50nm、平均直径大约lnm至大约40nm、平均直径大约 lnm至大约30nm、平均直径大约lnm至大约20nm、平均直径大约lnm至大约10nm、平均直径大 约5nm至大约150nm、平均直径大约5至大约50nm、平均直径大约10至大约30nm、平均直径大 约10至150nm、平均直径大约10至大约lOOnm、平均直径大约10至大约50nm、平均直径大约30 至大约l〇〇nm或者平均直径大约40至大约80nm〇
[0058] 在一些情况下，冠部包括附接至核酸相互作用复合物的一种或多种激动剂和/或 抗原的纳米颗粒核心。本文中使用的纳米颗粒核心是指没有任何附接的形式(modality)的 纳米颗粒构建体的纳米颗粒成分。在一些情况下，纳米颗粒核心是金属的。应当理解的是， 纳米颗粒核心、可以包含任何金属。金属的几种非限制性实例包括金、银、铂、错、钯、铜、钴、 铟、镍及其混合物。在一些实施方案中，纳米颗粒核心包含金。例如，纳米颗粒核心可以是包 括可降解金的晶格结构。纳米颗粒还可以包含半导体和磁性材料。
[0059] 与本发明的方面相容的纳米颗粒的非限制性实例被描述于并被通过引用并入自： 美国专利号7,238,472、美国专利公开号2003/0147966、美国专利公开号2008/0306016、美 国专利公开号2009/0209629、美国专利公开号2010/0136682、美国专利公开号2010/ 0184844、美国专利公开号2010/0294952、美国专利公开号2010/0129808、美国专利公开号 2010/0233270、美国专利公开号2011/0111974、PCT公开号W0 2002/096262、PCT公开号TO 2003/08539、PCT公开号W0 2006/138145、PCT公开号W0 2008/127789、PCT公开号W0 2008/ 098248、PCT公开号W0 2011/079290、PCT公开号W0 2011/053940、PCT公开号W0 2011/ 017690和PCT公开号W0 2011/017456。可以根据本领域已知的任何手段合成或可以市售获 得与本发明相关的纳米颗粒。例如纳米颗粒的市售供应商的几个非限制性实例包括:Ted Pella,Inc.,Redding,CA,Nanoprobes , Inc .,Yaphank,NY,Vacuum Metallurgical Co , ? Ltd.,Chiba,Japan和Vector Laboratories, Inc·,Burlington,CA〇
[0060] 核酸相互作用复合物的激动剂
[0061] 本文中使用的核酸相互作用复合物是指与核酸分子相互作用并且被刺激以产生 响应于该相互作用的免疫应答的分子或分子的复合物。例如，该分子或分子的复合物可以 是受体。在一些实施方案中，核酸相互作用复合物是模式识别受体(PRR)复合物。PRR是由识 别病原体相关分子模式(PAMP)的固有免疫系统的细胞所表达的蛋白质组成的免疫系统的 原始（primitive)部分，所述PAMP与微生物病原体或细胞应激以及损伤相关分子模式 (DAMP)相关，所述DAMP与细胞损伤过程中释放的细胞成分相关。PRR包括但不限于膜结合的 PRR，诸如受体激酶、Toll样受体(TLR)和C型凝集素受体(CLR)(甘露糖受体和无唾液酸糖蛋 白受体）；胞质PRR，诸如RIG-I样受体(RLR)、RNA解旋酶、植物PRR和非RD激酶；以及分泌的 PRR〇
[0062]核酸相互作用复合物包括但不限于TLR、RIG_I、转录因子、细胞翻译装置、细胞转 录装置、核酸作用酶和核酸相关自体抗原。其为核酸相互作用复合物的激动剂的核酸分子 包括但不限于TLR的激动剂和RIG-I、转录因子、细胞翻译装置、细胞转录装置、核酸作用酶 和核酸相关自体抗原的激动剂。
[0063]在一些实施方案中，核酸相互作用复合物的激动剂是TLR的激动剂。本文中使用的 TLR的激动剂是与TLR相互作用并刺激TLR的活性的核酸分子。
[0064] Toll样受体(TLR)是在哺乳动物的固有免疫中具有关键作用的高度保守的多肽家 族。已经鉴定了至少十个家族成员，被命名为TLR1-TLR10。各种TLR的胞质结构域的特征为 Toll-白介素 l(IL-l)受体(TIR)结构域。Medzhitov R等人（1998)Mol Cell 2:253-8。通过 TLR识别微生物入侵触发在拟南芥和哺乳动物中进化保守的信号传导级联的活化。已经报 道含有TIR结构域的接头蛋白MyD88与TLR相关并将IL-1受体相关激酶(IRAK)和肿瘤坏死因 子(TNF)受体相关因子6(TRAF6)募集至TLRJyDSS依赖的信号传导途径被认为导致NF-κΒ转 录因子和c-Jun NH2端激酶(Jnk)促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的活化，这些是免疫活化 和炎性细胞因子产生中的关键步骤。综述参见Aderem A等人(2000)Nature 406:782-87。
[0065] TLR被认为在各种组织中和各种类型的免疫细胞上差异表达。例如，已经报道，人 TLR7表达于胎盘、肺、脾、淋巴结、扁桃体中和类浆细胞前体树突状细胞(pDC)上。Chuang ΤΗ 等人 （2000)Eur Cytokine Netw ll:372-8);Kadowaki N 等人 （2001)J Exp Medl94:863-9。已经报道，人TLR8表达于肺、外周血白细胞（PBL)、胎盘、脾、淋巴结中和单核细胞上。 Kadowaki N等人（2001)J Exp Medl94:863_9;Chuang T-H等人（2000)Eur Cytokine Netw 11:372-8。据报道，人TLR9表达于脾、淋巴结、骨髓、PBL中和pDC和B细胞上。Kadowaki N等人 (2001)J Exp Med 194:863-9;Bauer S等人（2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:9237-42; Chuang T_H等人（2000)Eur Cytokine Netw 11:372-8。
[0066] 人和鼠 TLR7的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的。参见例如GenBank登录号： AF240467，AF245702，NM_016562，AF334942，NM_133211;和AAF60188，AAF78035，NP_057646， AAL73191以及AAL73192,其所有内容通过引用并入本文中。据报道，人TLR7长1049个氨基 酸。据报道，鼠 TLR7长1050个氨基酸。TLR7多肽包括具有富含亮氨酸的重复区域的胞外结构 域、跨膜结构域和包括TIR结构域的胞内结构域。
[0067] 人和鼠 TLR8的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的。参见例如GenBank登录号： AF246971，AF245703，NM_016610，XM_045706，AY035890，NM_133212;和AAF64061，AAF78036, NP_057694,XP_045706,AAK62677以及NP_573475,其所有内容通过引用并入本文中。据报 道，人TLR8以至少两种异形体（isoform)的形式存在，一种长1041个氨基酸而另一种长1059 个氨基酸。鼠 TLR8长1032个氨基酸。TLR8多肽包括具有富含亮氨酸的重复区域的胞外结构 域、跨膜结构域和包括TIR结构域的胞内结构域。
[0068] 人和鼠 TLR9的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的。参见例如GenBank登录号:NM_ 017442，AF259262,AB045180，AF245704，AB045181，AF348140，AF314224，NM_031178;和NP_ 059138，AAF72189，BAB19259，AAF78037，BAB19260，AAK29625，AAK28488 以及 NP_112455，其 所有内容通过引用并入本文中。据报道，人TLR9以至少两种异形体的形式存在，一种长1032 个氨基酸而另一种长1055个氨基酸。鼠 TLR9长1032个氨基酸。TLR9多肽包括具有富含亮氨 酸的重复区域的胞外结构域、跨膜结构域和包括TIR结构域的胞内结构域。
[0069]本文中使用的术语"TLR信号传导"是指与通过TLR信号传导相关的胞内信号传导 的任何方面。本文中使用的术语"TLR介导的免疫应答"是指与TLR信号传导相关的免疫应 答。
[0070] TLR7介导的免疫应答是与TLR7信号传导相关的应答。TLR7介导的免疫应答通常特 征为IFN-α和IFN诱导型的细胞因子(诸如IP-10和I-TAC)的诱导。在TLR7介导的免疫应答中 所诱导的细胞因子11-1€[/^、11^-6、几-8、11?-1€[/^和[?-3€[/^的水平小于在1'1^8介导的免 疫应答中所诱导的那些。
[0071] TLR8介导的免疫应答是与TLR8信号传导相关的应答。该应答的特征进一步在于促 炎细胞因子（诸如IFN-γ、IL-12p40/70、TNF-a、IL-la/^、IL- 6、IL-8、MIP_la/^和ΜΙΡ_3α/β) 的诱导。
[0072] TLR9介导的免疫应答是与TLR9信号传导相关的应答。该应答的特征进一步至少在 于IFN- γ和IL-12的产生/分泌，尽管其水平低于经TLR8介导的免疫应答所获得的水平。 [0073]本文中使用的"TLR7/8的激动剂"统指能够增加 TLR7和/或TLR8的信号传导的任何 核酸（即TLR7和/或TLR8的激动剂）。一些TLR7/8配体只诱导TLR7的信号传导(例如TLR7特异 性激动剂），一些只诱导TLR8的信号传导（例如TLR8特异性激动剂），而其他诱导TLR7和TLR8 二者的信号传导。
[0074] TLR7或TLR8信号传导的水平可以被增强至高于预先存在的信号传导的水平，或者 它可以被诱导至高于信号传导的背景。TLR7配体包括，但不限于，鸟苷类似物，例如C8取代 的鸟苷，基本上由G和U组成的核糖核苷酸、鸟苷核糖核苷酸和RNA或RNA样分子(PCT/US03/ 10406)的混合物，和基于腺苷的化合物(例如，6-氨基-9-苄基-2-(3-羟基-丙氧基)-9Η-嘌 呤-8-醇，以及由Sumi tomo制备的类似的化合物(如，CL-029))。
[0075] 如本文所使用的，术语"鸟苷类似物"是指具有涉及鸟嘌呤碱基，鸟苷核苷糖，或鸟 嘌呤碱基和鸟苷核苷糖两者的化学修饰的鸟苷样核苷酸(不包括鸟苷）。鸟苷类似物特别包 括，但不限于，7-脱氮鸟苷。
[0076] 鸟苷类似物进一步包括C8取代的鸟苷如7-硫杂-8-氧代鸟苷（immunosine)，8_巯 基鸟苷，8-溴鸟苷，8-甲基鸟苷，8-氧代-7，8-二氢鸟苷，C8芳基氨基-2 脱氧鸟苷，C8-丙炔 基-鸟苷，C8-和N7-取代的鸟嘌呤核糖核苷，如7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾），和7-甲 基_8_氧代鸟昔，8_氛基鸟昔，8_羟基_2'_脱氧鸟昔，8_羟基鸟昔，和7_脱氣_8_取代鸟昔。 [0077] TLR8配体包括主要由G和U组成的核糖核苷，鸟苷核糖核苷酸和RNA或RNA样分子 (PCT/US03/10406)的混合物。附加的TLR8配体也被公开于戈登等人的免疫学杂志.2005年， 174:1259-1268(Gorden et al.J.Immunol.2005，174:1259-1268))〇
[0078]本文中使用的术语"TLR9的激动剂"是指能够增加 TLR9的信号传导的任何药剂（BP TLR9的激动剂）。TLR9激动剂具体包括，但不限于，免疫刺激核酸，特别是CpG免疫刺激核酸。
[0079] 如本文所使用的，术语"免疫刺激CpG核酸"或"免疫刺激性CpG寡核苷酸"是指任何 含CpG的核酸，其能够激活免疫细胞。至少所述CpG二核苷酸的C通常是，但不一定，未甲基化 的。免疫刺激CpG核酸在许多授权的专利和公布的专利申请，包括美国专利号6194388; 6， 207，646; 6，218，371; 6，239，116; 6，339，068; 6406705;和6429199 中被描述。
[0080] 在一些实施方案中，核酸相互作用复合物的激动剂是免疫刺激性寡核苷酸。如本 文所使用的"免疫刺激性寡核苷酸"是包含免疫刺激性基序或骨干的任何核酸(DNA或RNA)， 免疫刺激性基序或骨干能够诱导免疫应答。免疫应答的诱导是指在免疫细胞数目或活性的 任何增加，或免疫因子，如细胞因子的表达或绝对水平的增加。免疫细胞包括，但不限于，NK 细胞，⑶4+T淋巴细胞，CD8+T淋巴细胞，B细胞，树突细胞，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞。细 胞因子包括，但不限于，白介素，TNF-α，IFN-α，β和γ，Flt配体，以及共刺激分子。免疫刺激 基序包括，但不限于CpG基序和富T基序。
[0081 ]免疫刺激性寡核苷酸的非限制性集包括：
[0082] dsRNA(TLR3):聚(A:C)和聚（I:C)
[0083] ssRNA(TLR7/8):
[0084] CCGUCUGUUGUGUGACUC(SEQ ID N0:13)
[0085] GCCACCGAGCCGAAGGCACC(SEQ ID NO:14)
[0086] UAUAUAUAUAUAUAUAUAUA(SEQ ID NO:15)
[0087] UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU(SEQ ID NO:16)
[0088] UUUUAUUUUAUUUUAUUUUA(SEQ ID NO:17)
[0089] UGUGUGUGUGUGUGUGUGUG(SEQ ID NO:18)
[0090] UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU(SEQ ID NO:19)
[0091] UUUGUUUGUUUGUUUGUUUG(SEQ ID NO :20)
[0092] UUAUUUAUUUAUUUAUUUAUUUAU(SEQ ID NO :21)
[0093] UUGUUUGUUUGUUUGUUUGUUUGU(SEQ ID NO :22)
[0094] GCCCGUCUGUUGUGUGACUC(SEQ ID N0:23)
[0095] GUCCUUCAAGUCCUUCAA(SEQ ID NO:24)
[0096] DNA(TLR9):
[0097] GGTGCATCGATGCAGGGGGG(SEQ ID NO:25)
[0098] TCCATGGACGTTCCTGAGCGTT(SEQ ID NO:26)
[0099] TCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQ ID NO:27)
[0100] TCGTCGACGATCCGCGCGCGCG(SEQ ID NO:28)
[0101] GGGGTCAACGTTGAGGGGGG(SEQ ID NO :29)
[0102] TC