>[0138]附接至纳米颗粒核心的形式
[0139]与本发明相关的形式(moda 1 ity)(包括核酸相互作用复合物的拮抗剂和抗原）可 以通过本领域任何已知的手段被附接至纳米颗粒核心。用于将寡核苷酸附接至纳米颗粒的 方法被详细描述于并通过引用并入自美国专利公开号2010/0129808。
[0140] 可以对纳米颗粒进行官能化以附接多核苷酸。备选地或另外，多核苷酸可以被官 能化。官能化的一个机制是烷基硫醇法(alkanethiol method)，从而在附接至金纳米颗粒 或包含其他金属、半导体或磁性材料的纳米颗粒之前用烷基硫醇在寡核苷酸的3 '或5 '末端 对寡核苷酸进行官能化。这样的方法被描述于例如Whitesides，Proceedings of the Robert A.Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry，Houston，Tex ·，pages 109-121 (1995)和Mucic等人Chem· Commun · 555-557 (1996)中。寡核苷酸还可以使用其他官能团（诸如硫代磷酸酯(phosophorothioate)基团） (如被描述于并通过引用并入自美国专利号5,472,881)或者取代的烷基硅氧烷(如被描述 于并通过引用并入自Burwel 1，Chemical Technology，4，370-377( 1974)和Matteucci和 Caruthers，J. Am. Chem. Soc ·，103,3185-3191(1981))被附接至纳米颗粒。在一些情况下，多 核苷酸通过用5'或3'硫代核苷(thionucleoside)终止该多核苷酸被附接至纳米颗粒。在其 他情况下，如描述于并通过引用并入自美国专利号6，361，944、6，506，569、6，767，702和6， 750,016和PCT公开号W0 1998/004740、W0 2001/000876、W0 2001/051665和W0 2001/ 073123,使用老化过程将多核苷酸附接至纳米颗粒。
[0141] 在一些情况下，核酸和/或抗原被共价附接至纳米颗粒核心，诸如通过金-硫醇键。 间隔子序列可以被包括在附接部位和摄取控制部分和/或结合部分之间。在一些实施方案 中，间隔子序列包含或由寡核苷酸、肽、聚合物或低聚乙烯组成。
[0142] 可以用多种化学物质设计纳米级构建体。例如，可以使用DTPA (二硫醇亚磷酰胺） 键。DTPA抵抗硫醇产生的荧光(flare)的胞内释放并可以用于提高信噪比。
[0143] 由本文中所述方法产生的缀合物比其他方法产生的那些显著更稳定。该增加的稳 定性是由于纳米颗粒核心表面上或形成冠部表面的寡核苷酸的密度增加。通过在表面活性 剂(例如大致为〇.01%的十二烷基硫酸钠(SDS)、吐温或聚乙二醇(PEG))的存在下进行盐加 成，可以在大约一小时中进行盐老化过程。
[0144] 表面密度可以取决于纳米颗粒的大小和类型并取决于寡核苷酸的长度、序列和浓 度。可以根据经验确定足以使纳米颗粒稳定的表面密度和针对纳米颗粒和寡核苷酸的期望 的组合获得该表面密度的必要条件。一般而言，具有至少10皮摩尔/cm的表面密度将足以提 供稳定的纳米颗粒-寡核苷酸缀合物。优选地，表面密度为至少15皮摩尔/cm。因为如果表面 密度过大，则可以减弱缀合物的寡核苷酸与靶杂交的能力，表面密度任选地不大于大约35-40皮摩尔/cm 2。还提供方法，其中寡核苷酸以至少10pmol/cm2、至少15pmol/cm2、至少 20pmol/cm 2、至少 25pmol/cm2、30pmol/cm2、至少 35pmol/cm2、至少 40pmol/cm2、至少 45pmol/ cm2、至少50pmol/cm2或50pmol/cm2或更多的表面密度结合至纳米颗粒。
[0145] 疗法
[0146] 本发明的方面涉及将纳米级构建体递送至受试者用于治疗和/或诊断用途。颗粒 可以单独进行施用或者在任何适当的药物学载体(诸如液体(例如盐水）、或粉末）中用于体 内施用。它们还可以用更大的载体颗粒或在施用装置内进行共递送。颗粒可以被配制。本发 明的制剂可以药学上可接受的溶液的形式被施用，所述溶液可以常规地含有药学上可接受 的浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、佐剂和任选地其他治疗成分。在一些实施方案 中，与本发明相关的纳米级构建体与诸如洗剂(例如羊毛脂制剂(aquaphor))的物质混合并 被施用至受试者的皮肤，从而该纳米级构建体通过受试者的皮肤进行递送。应当理解的是， 本领域已知的任何递送纳米颗粒的方法可以与本发明的方面相容。
[0147] 对于治疗用途，可以任何将颗粒递送至期望细胞的模式将有效量的颗粒施用至受 试者。可通过本领域技术人员已知的任何手段完成施用药物组合物。施用途径包括但不限 于口服、肠胃外、肌内、静脉内、皮下、粘膜、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼、阴道、皮肤、直肠和 通过直接注射。
[0148] 因此，本发明在一个方面涉及核酸相互作用复合物的激动剂高效介导免疫刺激作 用的发现。核酸相互作用复合物的这些激动剂治疗性和预防性用于刺激免疫系统以治疗癌 症、感染性疾病、变态反应、哮喘、自身免疫性疾病和其他病症，并且在癌症化疗后帮助提供 针对机会性感染的保护。由例如，TLR激动剂刺激产生的强大而平衡的、细胞和体液免疫应 答反映对抗入侵的病原体和癌细胞的人体自身天然防御系统。
[0149] 因此，核酸相互作用复合物的激动剂在本发明的一些方面用作疫苗，所述疫苗用 于治疗具有发展成以下疾病的风险的受试者或患有以下疾病的受试者:变态反应或哮喘、 感染性生物的感染或者其中特定癌症抗原已被鉴定的癌症。核酸相互作用复合物的激动剂 还可以在没有用于感染、变态反应或癌症防护的抗原或变应原的情况下进行给予，并且在 该情况下，重复剂量可能允许更长期的防护。本文中使用的具有风险的受试者是其具有暴 露于引起感染的病原体或癌症或变应原的风险或具有发展成癌症的风险的受试者。例如， 有风险的受试者可以是计划前往发现有特殊类型感染因子的区域旅游的受试者，或者它可 以是通过生活方式或医疗程序被暴露于可能含有感染性生物体的体液或直接暴露于感染 性生物体的受试者或甚至在已确定有传染性生物体或过敏原的区域生活的任何受试者。有 发展感染风险的受试者还包括被医疗机构建议采用特定传染性生物体抗原接种的普通人 群。如果抗原是变应原和受试者发展对特定抗原的变应性应答并且受试者可以即在花粉季 节暴露于抗原，那么该受试者处于暴露于抗原的风险。
[0150]患有感染的受试者是已被暴露于感染性病原体并在体内具有急性或慢性可检测 的病原体水平的受试者。在采用或不采用抗原的情况下可以使用所述CpG免疫刺激性寡核 苷酸，以设置抗原特异性全身或粘膜免疫应答，所述应答能够减少感染性病原体的水平或 根除感染性病原体。如本文中所使用的传染病是由体内外来微生物的存在而引起的疾病。 特别重要的是，开发有效的疫苗策略和治疗，以保护身体的粘膜表面，这是致病进入的主要 位点。
[0151]患有变态反应的受试者是患有或者具有发展成响应于变应原的变态反应的风险 的受试者。变态反应是指对物质(变应原）的获得性超敏反应。变应病况(condi t ion)包括但 不限于湿疹、变应性鼻炎或鼻炎(coryza)、花粉症(hay fever)、结膜炎、支气管哮喘、荨麻 疹(麻疹(hives))和食物变态反应，以及其他特应性病况。
[0152] 患有癌症的受试者是具有可检测的癌细胞的受试者。所述癌症可以是恶性或非恶 性癌症。癌症或肿瘤包括但不限于胆管癌;脑癌;乳腺癌；宫颈癌;绒毛膜癌;结肠癌;子宫内 膜癌;食管癌；胃癌;上皮内肿瘤;淋巴瘤;肝癌;肺癌(例如小细胞和非小细胞）；黑色素瘤； 神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌;直肠癌；肉瘤;皮肤癌；睾丸癌；甲状腺 癌;和肾癌，以及其他癌和肉瘤。在一个实施方案中，癌症是多毛细胞白血病，慢性骨髓性白 血病，皮肤T细胞白血病，多发性骨髓瘤，滤泡性淋巴瘤，恶性黑色素瘤，鳞状细胞癌，肾细胞 癌，前列腺癌，膀胱细胞癌，或结肠癌。
[0153] 受试者应当是指人或脊椎动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、 鸡、灵长类动物例如猴、和鱼(水产养殖品种)例如鲑鱼。因此，本发明还可以被用于治疗非 人受试者中的癌症和肿瘤、感染和变态反应/哮喘。
[0154] 本文中使用的术语"治疗（treat、treated或treating)"在针对诸如感染性疾病、 癌症、变态反应或哮喘的紊乱使用时是指预防性治疗(其提高受试者对疾病发展(例如病原 体的感染)的抗性或者换句话说降低受试者会发展成疾病(例如变成被病原体感染)的可能 性）以及受试者已经发展成疾病之后为了抵抗疾病(例如降低或消除感染)或防止疾病变得 恶化的治疗。
[0155] 本文中使用的抗原是能够激发免疫应答的分子。抗原包括但不限于细胞、细胞提 取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽和非肽模拟物、小分子、月旨 质、糖脂、糖类、病毒和病毒提取物和多细胞生物诸如寄生物和变应原。术语抗原大致包括 任何类型的分子，其被宿主免疫系统识别为外源的。抗原包括但不限于癌症抗原、微生物抗 原和变应原。
[0156] 如本文所用的术语"癌症抗原"和"肿瘤抗原"可以互换使用，以意指由癌症细胞差 异表达的并且由此可以被利用以靶向癌细胞的抗原。癌抗原是可潜在地刺激明显的肿瘤特 异性免疫应答的抗原。正常细胞编码这些抗原中的一些，虽然不一定表达这些抗原中的一 些。这些抗原可表征为，那些通常在正常细胞中沉默的（即，不被表达的），那些只在分化的 某些阶段被表达和那些在暂时被表达的，例如胚胎和胎儿抗原。其它癌抗原由突变的细胞 基因，如癌基因（例如，活化的ras癌基因），抑制基因（例如，突变的p53)，由内部缺失或染色 体易位产生的融合蛋白编码。仍其它癌抗原可以由病毒基因，如那些在RNA和DNA肿瘤病毒 上携带的病毒基因进行编码。癌症抗原是与肿瘤或癌细胞表面相关的化合物(诸如肽或蛋 白质)并且当在MHC分子中的抗原提呈细胞的表面上表达时其能够激发免疫应答。癌症抗原 可以通过以下方法从癌症细胞制备:通过例如Cohen等人，1994，Cancer Research，54:1055 中所述的制备癌细胞的粗提物、通过部分纯化抗原、通过重组技术或者通过已知抗原的从 头合成。
[0157] 本文中使用的微生物抗原是微生物的抗原并且包括但不限于病毒、细菌、寄生物 和真菌。这样的抗原包括完整的微生物以及其天然分离物和片段或衍生物，以及还包括与 天然微生物抗原相同或相似并诱导特异性针对该微生物的免疫应答的合成的化合物。如果 化合物诱导对天然微生物抗原的免疫应答(体液的和/或细胞的），那么该化合物类似于天 然微生物抗原。这样的抗原被常规用于本领域并且是本领域普通技术人员所众所周知的。
[0158] 已在人类中被发现的病毒的例子包括，但不限于:逆转录病毒科(如人免疫缺陷病 毒，如HIV-1 (也被称为HDTV-ΠΙ LAVE或HTLV-IE/LAV，或HIV-III;及其他分离物，例如HIV-LP;小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒;肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻 病毒，艾柯病毒杯状病毒科(如引起肠胃炎的菌株披膜病毒科(例如马脑炎病毒，风疹 病毒）;黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒，脑炎病毒，黄热病毒）；冠状病毒科(例如， 冠状病毒）；弹状病毒科(例如水泡性口炎病毒，狂犬病毒）;丝状病毒科(例如埃博拉病毒）； 副粘病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒）；正粘病毒科(例如 流感病毒）；布尼亚病毒科(811邱3￥；[1^(136)(如汉坦病毒，邦加(811邱3)病毒，白铃病毒和内 罗毕病毒沙粒病毒科（出血热病毒呼肠病毒科(如呼肠病毒，环状病毒和轮状病毒双 核糖核酸病毒科;嗜肝DNA病毒科（乙型肝炎病毒）；细小病毒科(细小病毒）；乳多空病毒科 (乳头状瘤病毒，多瘤病毒）；腺病毒科(大部分腺病毒）；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)l 和2,水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒;痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病 毒）；和虹彩病毒科(虹膜病毒科）（如非洲猪痕热病毒）；和未分类病毒(例如丁型肝炎因子 (被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星(defective satellite))，非甲型肝炎因子、非乙肝炎 因子（1类=内部传播;2类=肠胃外传播（即丙型肝炎）；诺瓦克病毒和相关的病毒，以及星 状病毒)。
[0159] 革兰氏阴性和革兰氏阳性菌作为在脊椎动物中的抗原。例如革兰氏阳性菌包括但 不限于巴斯德菌属(Pasteure 11a species)，葡萄球菌属(Staphylococci species)和链球 菌属（Streptococcus species)。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)，假单胞菌属(Pseudomonas)，和沙门氏菌属(Salmonella species)。传染性细菌的具 体实例包括但不限于：幽门螺杆菌（Helicobacter pyloris)，布氏疏螺旋体（Borelia burgdorferi)，嗜肺军团菌（Legionella pneumophilia)，分枝杆菌属（Mycobacteria sps) (例如结核分枝杆菌（Μ . tuberculos i s )，鸟分枝杆菌（Μ . avium)，胞内分枝杆菌 (M. intracellulare)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)，戈氏分枝杆菌(M.gordonae))，金黄色 葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈 瑟球菌（Neisseria meningitidis)，单核细胞增多性李司或菌（Listeria monocytogenes)，酿胺链球菌（Streptococcus pyogenes) (A群链球菌（Group A Streptococcus))，无乳链球菌（Streptococcus agal act iae) (B群链球菌（Group B Streptococcus))，链球菌（Streptococcus)(草绿色组（viridans group))，类链球菌 (Streptococcus faecalis)，牛链球菌（Streptococcus bovis)，链球菌（厌氧种），肺炎链 球菌（Strep toco ecus pneumoniae)，致病性弯曲杆菌属（pathogenic Campylobacter sp.)，肠球菌属(Enterococcus sp.)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，蜂芽胞杆 菌（Bacillus antracis)，白喉棒状杆菌（corynebacterium diphtheriae)，棒状杆菌属 (corynebacter ium sp ·)，丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae )，芬氏梭菌 (Clostridium perfringers)，破伤风梭菌（Clostridium tetani)，产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)，多杀巴斯德氏菌 (卩&8加代113 111111加。1(1&)，拟杆菌属（8&(^61'〇1(16 8 8卩.），具核梭杆菌$118(^&(^61'；!_11111 nucleatum)，念珠状链杆菌（Streptobacillus moniliformis)，苍白密螺旋体（Treponema pallidium)，细弱密螺旋体（Treponema pertenue)，钩端螺旋体（Leptospira)，立克次氏体 (Rickettsia)，依氏诺卡氏菌(Actinomyces israelii) 〇
[0160] 真菌的实例包括新型隐球菌（Cryptococcus neof ormans)，荚膜组织胞楽菌 (Hi s top lasma capsulatum)，粗球抱子菌（Coccidioides immitis)，皮炎芽生菌 (Blastomyces dermatitidis)，沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis)，白色念珠菌 (Candida albicans)〇
[0161 ] 其他传染性生物体（即，原生生物)包括疱原虫属(Plasmodium spp) 如恶性疱原 虫（Plasmodium fal c iparum)，三曰症原虫（Plasmodium malariae)，卵形症原虫 (Plasmodium ovale)和间日症原虫（Plasmodium vivax)和弓形虫（Toxoplasma gondii)〇 血源性和/或组织寄生虫包括疱原虫属，果氏巴贝虫（Babesia microti )，分歧巴贝虫 (Babesia divergens)，热带利什曼原虫（Lei shman ia tropica)，利什曼原虫属 (Leishmania spp ·)，巴西利什曼原虫（Leishmania brazi 1 iensis)，杜氏利什曼原虫 (Lei shmania donovani )，闪比亚维虫（Trypanosoma gambiense )和罗