GTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:30)
[0103] TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO :31)
[0104] GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO :32)
[0105] GGGGACGACGTCGTGGGGGGG(SEQ ID NO :33)
[0106] TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO:34)
[0107] TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQ ID NO:35)
[0108] 免疫刺激性寡核苷酸可以连接到核心或彼此连接或与其它分子如抗原连接。例 如，寡核苷酸可经5'末端或3'末端缀合至接头。例如。[序列，5'_3']_接头或接头-[序列， 5，-3，]。
[0109] 可互换使用术语"寡核苷酸"和"核酸"指多个核苷酸（即包含被连接至磷酸基团和 被连接至可更换(exchangeab 1 e)的有机碱基的糖(例如核糖或脱氧核糖）的分子），所述碱 基是取代的嘧啶（例如胞嘧啶（C)、胸腺嘧啶（T)或尿嘧啶（U))或取代的嘌呤（例如腺嘌呤 (A)或鸟嘌呤(G))。因此，该术语包括DNA和RNA二者的寡核苷酸。该术语应当还包括多核苷 (即多核苷酸去掉磷酸)和任何其他含有有机碱基的聚合物。可以从现有的核酸源(例如基 因组或cDNA)获得寡核苷酸，但优选是合成的(例如通过核酸合成生产的）。纳米级构建体的 并且任选被附接至纳米颗粒核心的多核苷酸可以是单链或双链的。双链多核苷酸在本文中 也被称为双链体。本发明的双链寡核苷酸可以包含两条分开的互补核酸链。
[0110]本文中使用的"双链体"包括双链核酸分子，其中互补序列彼此氢键键合。互补序 列可以包括有义链和反义链。反义核苷酸序列可以与靶基因相同或足够相同以介导对靶基 因序列的有效靶基因抑制（例如至少大约98%相同、96%相同、94%、90%相同、85%相同或 80%相同）。
[0111] 双链多核苷酸可以是在其全长上是双链的，这意味着它没有突出（overhanging) 的单链序列并因此是平端的。在其他实施方案中，双链多核苷酸的两条链可以具有不同的 长度，产生一个或多个单链突出端(overhang)。本发明的双链多核苷酸可以含有错配和/或 环或凸起(bulge)。在一些实施方案中，在寡核苷酸至少大约70%、80%、90%、95%、96%、 97 %、98%或99%的长度上它是双链的。在一些实施方案中，本发明的双链多核苷酸含有至 少或达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
[0112] 与本发明相关的多核苷酸可以在诸如糖部分、磷酸二酯键和/或碱基处被修饰。本 文中使用的"糖部分"包括天然的、未修饰的糖(包括戊糖、核糖和脱氧核糖）、修饰的糖和糖 类似物。糖部分的修饰可以包括用卤素、杂原子或脂肪族基团取代羟基，并且可以包括羟基 官能化为例如醚、胺或硫醇。
[0113] 糖部分的修饰可以包括2 甲基核苷酸，这被称为"甲基化的"。在一些情况下， 与本发明相关的多核苷酸可以只含有修饰的或未修饰的糖部分，而在其他情况下，多核苷 酸含有一些修饰的糖部分和一些未修饰的糖部分。
[0114] 在一些情况下，修饰的核单体(nucleomonomer)包括糖被修饰的或主链被修饰的 核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸可以含有非天然存在的碱基，诸如在5'位置被修饰的尿苷 或胞苷，例如5 ' - (2-氨基)丙基尿苷和5 溴尿苷;在8位置被修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴 鸟苷;脱氮杂核苷酸，例如7-脱氮杂-腺苷;和N-烷基化的核苷酸，例如N6-甲基腺苷。此外， 糖被修饰的核糖核苷酸可以具有用H、烷氧基(或OR)、R或烷基、卤素、SH、SR、氨基(诸如NH 2、 NHR、NR2)或CN基团取代的2'-OH基因，其中R是低级烷基、烯基(alkenyl)或炔基(alkynyl)。 在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸可以具有用修饰的基团(诸如硫代磷酸酯基团）取代 的连接至相邻核糖核苷酸的磷酸二酯基团。
[0115] 在一些方面，2' -0-甲基修饰对于降低不期望的细胞应激应答(诸如对双链核酸的 干扰素应答)可能是有利的。修饰的糖可以包括D-核糖、2' -〇-烷基(包括2' -〇-甲基和2' -〇-乙基），即2'-烷氧基、2'-氛基、2' -S-烷基、2'-卤素(halo)(包括2'-氣）、2'-甲氧乙氧基、 2'-烯丙氧基(_〇CH2CH = CH2)、2~炔丙基、丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基等。糖部 分还可以是己糖。
[0116] 术语"烷基"包括饱和脂肪族基团，包括直链烷基（例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊 基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等），支链烷基（异丙基、叔丁基、异丁基等），环烷基（脂环 族)基团（环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基），烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷 基。在一些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有 6个或更少的碳原子(例如直链Cl-C6,支链C3-C 6)，并且更优选地4个或更少。同样，优选的环烷基在它们的环结构中具有3至8 个碳原子，并且更优选地在环结构中具有5或6个碳。术语Q-C6包括含有1至6个碳原子的烷 基。
[0117] 除另有规定外，术语烷基包括"未取代的烷基"和"取代的烷基"二者，其中后者是 指具有独立选定的取代基的烷基部分，所述取代基取代烃主链的一个或多个碳上的氢。这 样的取代基包括例如烯基，炔基，卤素，羟基，烷基羰氧基，芳基羰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧 基幾氧基，駿酸醋，烷基幾基，芳基幾基，烷氧基幾基，氣基幾基，烷基氣基幾基，^烷基氣基 羰基，烧硫基羰基，烷氧基，磷酸基（phosphate)，膦酸基（phosphonato)，次膦酸基 (phosphinato)，氰基，氨基(包括烷基氨基，二烷基氨基，芳基氨基，二芳基氨基，和烷基芳 基氨基），酰氨基(包括烷基羰基氨基，芳基羰基氨基，氨甲酰基和脲基），脒基，亚氨基，巯基 (sulfhydryl )，烧硫基，芳硫基，硫代羧酸基(thiocarboxy late )，硫酸基(sulfate )，烷基亚 硫酰基，磺酸基(sulfonato)，氨磺酰基，磺酰氨基(sulfonamido)，硝基，三氟甲基，氰基，叠 氮基，杂环基，烷基芳基，或芳族或杂芳族部分。环烷基可以被进一步取代，例如，用上述取 代基取代。"烷基芳基"或"芳基烷基"部分是用芳基(例如苯甲基(苄基））取代的烷基。术语 "烷基"还包括天然和非天然氨基酸的侧链。术语"正烷基"是指直链(即未分支的）未取代的 烷基。
[0118] 术语"烯基"包括在长度和可能的取代上类似于上述烷基的不饱和脂肪族基团，但 其含有至少一个双键。例如，术语"烯基"包括直链烯基（例如乙烯基(ethylenyl)、丙烯基、 丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等），支链烯基，环烯基(脂环族)基 团（环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基），烷基或烯基被取代的环烯基，和 环烷基或环烯基被取代的烯基。在一些实施方案中，直链或支链烯基在其主链中具有6个或 更少的碳原子(例如直链C 2_C6,支链C3-C6)。同样，环烯基在它们的环结构中具有3至8个碳 原子，并且更优选地在环结构中具有5或6个碳。术语C 2-C6包括含有2至6个碳原子的烯基。
[0119] 除另有规定外，术语烯基包括"未取代的烯基"和"取代的烯基"二者，其中后者是 指具有独立选定的取代基的烯基部分，所述取代基取代烃主链的一个或多个碳上的氢。这 样的取代基包括例如烷基，炔基，卤素，羟基，烷基羰氧基，芳基羰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧 基幾氧基，駿酸醋，烷基幾基，芳基幾基，烷氧基幾基，氣基幾基，烷基氣基幾基，^烷基氣基 幾基，烧硫基幾基，烷氧基，憐酸基，勝酸基，次勝酸基，氛基，氣基(包括烷基氣基，^烷基氣 基，芳基氣基，^芳基氣基，和烷基芳基氣基），醜氣基(包括烷基幾基氣基，芳基幾基氣基， 氣甲醜基和脈基），脉基，亚氣基，疏基，烧硫基，芳硫基，硫代駿酸基，硫酸基，烷基亚硫醜 基，磺酸基，氨磺酰基，磺酰氨基，硝基，三氟甲基，氰基，叠氮基，杂环基，烷基芳基，或芳族 或杂芳族部分。
[0120] 术语"疏水修饰"是指碱基的修饰，使得总疏水性得到增加并且碱基仍然能够形成 接近常规沃森-克里克相互作用。碱基修饰的非限制性实例包括5-位置尿苷和胞苷修饰像 苯基、4-吡啶基、2-吡啶基、吲噪基、和异丁基、苯基(C6H5OH);色氨酰基(C 8H6N)CH2CH(NH2) CO)、异丁基、丁基、氣基苄基;苯基;奈基。
[0121]术语"杂原子"包括除碳或氢以外的任何元素的原子。在一些实施方案中，优选的 杂原子是氮、氧、硫和磷。术语"羟基(hydroxy)"或"羟基(hydroxy 1)"包括具有-OH或-0- (具 有适当的配对离子(counterion))的基团。术语"卤素"包括氟、溴、氯、碘等。术语"全卤化的 (perhalogenated)" 一般是指其中所有的氢均用卤素原子取代的部分。
[0122]术语"取代基（substituted)"包括独立选定的取代基，其能够被置于部分上并且 其允许分子执行它的预期功能。取代基的实例包括烷基、烯基、炔基、芳基、（CWV3NR' R〃、（ ClT R〃）〇-3CN、N〇2、卤素 、（ClT R〃）〇-3C(卤素）3、（ ClT R〃）〇-3CH(卤素)2、（ ClT R〃）〇-3CH2 (卤 素）、（ClT R〃）〇-3C0NR' R〃、（ ClT R〃）〇-3S (0) i-2NR' R〃、（ ClT R〃）〇-3CH0、（ ClT R〃）〇-3〇(ClT R〃）〇-3H、 (CV R〃）0-33(0)0-21^、（Cf R〃）ο-3〇(〇Τ R〃）o-3H、（Cf R〃）o-3⑶V、（CV R〃）o-3⑶2R'或（Cf R〃）ο-30IT基团；其中每个f和R〃各自独立地为氢、Ci-Cs烷基、C2-C5烯基、C 2-C5炔基或芳基， 或者V 和R〃一起为亚苄基(benzylidene group)或一(CH2)2〇(CH2)2-基团。
[0123] 术语"胺"或"氨基"包括其中氮原子共价键合到至少一个碳或杂原子的化合物或 部分。术语"烷基氨基"包括其中氮结合到至少一个另外的烷基的基团和化合物。术语"二烷 基氨基"包括其中氮原子结合到至少两个另外的烷基的基团。
[0124] 术语"醚"包括含有键合到两个不同的碳原子或杂原子的氧的化合物或部分。例 如，该术语包括"烷氧基烷基"，其是指共价键合到氧原子的烷基、烯基或炔基，所述氧原子 共价键合到另一烷基。
[0125] 术语"碱基"包括已知的嘌呤和啼啶杂环碱基、脱氮杂嘌呤，及其类似物(包括杂环 被取代的类似物，例如氨基乙氧基吩噁嗪(aminoethyoxy phenoxazine))、衍生物（例如1-烷基-、1-烯基-、杂芳族-和1-炔基衍生物)和互变异构体。嘌呤的实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、 肌苷、二氨基嘌呤和黄嘌呤及其类似物（例如8-氧代-N 6-甲基腺嘌呤或7-二氮杂黄嘌呤 (diazaxanthine))和衍生物。嘧啶包括例如胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶，和它们的类似物 (例如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4,4_乙 醇胞啼啶(ethanocytosine))。合适的碱基的其他实例包括非噪呤基和非啼啶基碱基，诸如 2_氨基吡啶和三嗪。
[0126] 在一些方面，本发明的多核苷酸的核单体是RNA核苷酸，包括修饰的RNA核苷酸。
[0127] 术语"核苷"包括被共价附接至糖部分(优选核糖或脱氧核糖)的碱基。优选核苷的 实例包括核糖核苷和脱氧核糖核苷。核苷还包括被连接至氨基酸或氨基酸类似物的碱基， 所述氨基酸或氨基酸类似物可以包含游离羧基、游离氨基或保护基团。合适的保护基团是 本领域众所周知的（参见P.G.M.Wuts和T.W.Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis"，2nd Ed.，Wiley-Interscience,New York,1999)。
[0128] 术语"核苷酸"包括进一步包含磷酸基团或磷酸类似物的核苷。
[0129] 本文中使用的术语"键"包括天然存在的、未修饰的磷酸二酯部分(-0-(P02J-0-)， 其共价连接相邻核单体。本文中使用的术语"取代键(substitute 1 inkage)"包括共价连接 相邻核单体的天然磷酸二酯基团的任何类似物或衍生物。取代键包括磷酸二酯类似物，例 如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、和? -乙氧基磷酸二酯(？11：117(?7。1108。110(1丨68七61')、？-乙氧 基磷酸二酯(？-6丨11(?7口1108口110(1丨68丨61')、？-烷氧基磷酸三酯、膦酸甲酯和不含磷的键，例如 缩醛和酰胺。这样的取代键是本领域已知的（例如Bjergarde等人1991 .Nucleic Acids Res · 19:5843;Caruthers等人1991 .Nucleosides Nucleotides · 10 :47)。在某些实施方案 中，优选不易水解的键，诸如硫代磷酸酯键。
[0130] 在一些方面，本发明的多核苷酸包含3'和5'末端(除了环形寡核苷酸）。可以通过 例如修饰3'或5'键基本上保护多核苷酸的3'和5'末端免受核酸酶降解(参见美国专利号5， 849，902和W0 98/13526)。可以通过包含"封闭基团（blocking group)"使寡核苷酸具有抗 性。本文中使用的术语"封闭基团"是指能够被附接至寡核苷酸或核单体的取代基(例如除 了0H基团），作为用于合成的保护基团或连接基团（例如FITC、丙基(CH 2-CH2-CH3)、二醇(-0-CH2-CH2-O-)、磷酸（P〇3 2-)、膦酸氢基（hydrogen phosphonate)或亚磷酰胺 (phosphoramidite))。"封闭基团"也包括保护寡核苷酸的5'和3'末端的"封端基团"或"阻 止外切核酸酶的基团"，包括修饰的核苷酸和非核苷酸外切核酸酶抗性结构。
[0131] 示例性封端基团包括帽结构(例如7-甲基鸟苷帽）、倒位的核单体，例如具有3'-3' 或5' -5'端倒位（inversion)(参见例如Ortiagao等人 1992 .Antisense Res .Dev · 2:129)、勝 酸甲酯、亚磷酰胺、非核苷酸基团（例如非核苷酸接头(linker)、氨基接头、缀合物)等。3'末 端核单体可以包含修饰的糖部分。3'末端核单体包含能够任选地被封闭基团取代的3'-0， 所述封闭基团防止3'-外切核酸酶降解寡核苷酸。例如，3'-羟基可以通过3' 43'核苷酸间 键被酯化成核苷酸。例如，烷氧基可以是甲氧基、乙氧基或异丙氧基，并且优选乙氧基。任选 地，在3'末端被3' 43'连接的核苷酸可以通过取代键进行连接。为了减少核酸酶降解，5'大 部分键可以是修饰的键，例如硫代磷酸酯键或P-烷氧基磷酸三酯键。优选地，两种5' 大部分3Z-5'键是修饰的键。任选地，5'末端羟基部分可以用含磷的部分进行酯化，例如磷 酸酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸酯。
[0132] 在一些方面，多核苷酸可以包含DNA和RNA二者。
[0133] 在一些方面，连续多核苷酸的至少一部分通过取代键(例如硫代磷酸酯键)进行连 接。由于它们针对血清蛋白具有更高的亲和力，取代键的存在可以改善药物动力学。
[0134] CpG序列在人DNA中是比较少见的，而在传染性生物体，如细菌的DNA中通常被发 现。人体免疫系统显然已经发展成识别作为感染早期预警信号的CpG序列，并启动针对入侵 病原体的直接和强大的免疫应答，而不会引起采用其他免疫刺激剂经常看到的不良反应。 因此，包含CpG的核酸依靠这种先天免疫防御机制，可以利用用于免疫治疗的独特自然途 径。CpG核酸对免疫调节的影响已在以下中被广泛描述:美国专利第6194388号，和公开的专 利申请，例如PCT US95/01570)，PCT/US97/19791，PCT/US98/03678;PCT/US98/10408;PCT/ US98/04703;PCT/US99/07335;和PCT/US99/09863。
[0135] "CpG寡核苷酸"是一种核酸，其包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。在一些实 施方案中，核酸包括三个或更多个未甲基化的CpG二核苷酸。含有至少一个"非甲基化CpG二 核苷酸"的核酸是核酸分子，其包含在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列中的非甲基化胞嘧啶 (即"CpG DNA"或包含5 '胞嘧啶的DNA，所述5 '胞嘧啶之后是3 '鸟苷并且通过磷酸键连接)和 活化免疫系统。
[0136] 纳米级构建体的免疫刺激性寡核苷酸优选在长6至100个碱基的范围中。但是，如 果存在足够多的免疫刺激性基序，任何大小大于6个核苷酸(甚至许多长kb)的核酸能够诱 导根据本发明的免疫应答。优选地，免疫刺激性核酸的大小范围在8至100个核苷酸之间并 且在一些实施方案中在8至50个核苷酸之间或8至30个核苷酸之间。
[0137]在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有修饰的主链，诸如硫代磷酸酯(PS) 主链。在其他实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有磷酸二酯(P0)主链。在又一些其他实施 方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有混合的P0和PS主链。