与在溶液中的核酸相互作用复合物(CpG 寡核苷酸）的未配制的激动剂后细胞因子分泌水平。检验了，在纳米颗粒和TRL激动剂组都 具有磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸间键的寡核苷酸对细胞因子诱导的影响（图4)。将RAW-Blue 巨噬细胞以每孔 65000 个细胞铺板并使其附着过夜 。在实验的当天 ，将指定化合物与细 胞孵育过夜。由收集上清液并通过ELISA(TNF-a-顶部图片，IL-12-右下图片，IL-6-左下图 片）测定指定细胞因子的浓度，来确定细胞因子分泌的程度。结果显示，与CpG 1826-ps， CpG1826-po,和指定对照相比，可以使用AST-008-ps和AST-008-po在低剂量实现显著较高 的细胞因子的分泌。例如，为了实现大于2000皮克(pg)/毫升的TNF-a，需要小于lOOnM AST-008-ps 和需要小于 ΙΟΟΟηΜ 的 AST-007-po,但需要大于 ΙΟΟΟηΜ 的 CpG 1826-ps。
[0187] 接着，检查了，响应于采用磷酸二酯CpG寡核苷酸的本发明纳米级的刺激的TLR9活 化，其与溶液中的磷酸二酯和硫代磷酸酯CpG寡核苷酸相比较（图5)。根据制造商推荐的方 案、使用所指定的化合物和对照，接种和活化RAW-Blue或THPl-XBlue细胞。值得注意的是， AST-007-po，AST-008-po和AST-009-po在与CpG 7909-ps(已知和优化的TLR 9激动剂）相似 的剂量显示相媲美的活化。此外，活化似乎是依赖于TLR 9,因为TLR 9激动剂不灵敏THP1-XBlue细胞不表现出任何的活化。
[0188]确定的是，相对于几个不同的CpG oligo序列，本发明的纳米级构建体的效力增加 数倍（图6)。根据制造商的推荐方案、使用指定化合物和对照，接种和活化Ramos-Blue细胞。 对Oligo 1826(顶部图片）和1668(下部图片)进行了测试。值得注意的是，与对照相比，SNA 化合物显示比游离oligo显著较低EC 50值，这是独立于化学的。这表明，对于这些序列， ο 1 i go的SNA制剂是几倍更有效的。
[0189]对调节纳米颗粒核心大小的影响进行了检查（图7)。将Raw Blue细胞铺板和采用 指定激动剂处理，所述激动剂具有不同金核心大小，其范围是从3.5纳米-13纳米(使用所示 的oligo)。结果显示:较小的金核心大小似乎具有提高体外激动剂活性的潜能。
[0190]观察到本发明的纳米级构建体比CpG oligo具有更快速和持续的活化（图8)。如所 描述将细胞铺板和使用QuantiBlue测定活化。结果表明，在6nM oligo，PS SNA显示比游离 1668PS oligo显著更多的活化。
[0191] 检查了，硫代磷酸酯修饰以序列依赖性的方式调节激动剂活性的能力（图9)。将 Raw Blue铺板并用指定激动剂处理。对Oligo 1826(顶部图片)和1668(下部图片)进行了测 试。结果表明，内部硫代磷酸酯修饰(C*G)和2个5'硫代磷酸酯键(5'PS2)具有似乎是序列依 赖性的对免疫刺激SNA活性的效果。
[0192] 评估了，寡核苷酸负荷密度影响激动剂活性的能力（图10)。￥2表示，在将oligo加 入金核心之前，该构建体完全被金涂覆。测试了，磷酸二酯寡核苷酸(顶部图片)和硫代磷酸 酯寡核苷酸(底部图片）。数据显示，寡核苷酸在金表面上的密度将调节免疫构建体的活性。
[0193] 对CpG Ρ0/Ρ0纳米级构建体的活化的时间进程进行了研究（图11)。在孵育>4小时 之前测试构建体不会被活化。将Raw Blue铺板并用指定激动剂处理。结果表明，在孵育大于 4小时前P0和P0 SNA没有稳健地活化粘附的RAW Blue细胞。
[0194] 5'Chol CpG P0纳米级构建体在低nM范围表现出活化，而5'C18废除了活性（图 12)。5 '胆固醇修饰(5 ' Cho 1)可能会以不依赖ο 1 igo剂量的方式增加激动剂的效力，特别是 在低浓度时，可能会以不依赖oligo剂量的方式增加激动剂的效力。采用C18分子对5'末端 的修饰(5'C18)似乎完全消除活性。
[0195] 对于随后的活化，预铺板的巨噬细胞是被更多预处理的（图13)。在加入激动剂化 合物(顶部)之前将RAW-Blue巨噬细胞过夜铺板，与将细胞铺板并同时加入激动剂化合物 (底部）的情况相比，所述RAW-Blue巨噬细胞通常显示更大活化。
[0196] 被证实的是，由巨噬细胞导致低水平的IFN- γ分泌（图14)。将RAW-Blue巨噬细胞 以每孔65000个细胞铺板并使其附着过夜。在实验的当天，将指定化合物与细胞孵育过夜。 通过收集上清液并通过ELI SA测定指定细胞因子的浓度，来确定细胞因子的分泌的程度(治 疗后24小时-左侧图片或48小时右侧图片）。结果表明，这些化合物刺激的RAW-Blue巨噬细 胞没有产生明显程度的IFN-γ。
[0197] 实施例2免疫肿瘤学和免疫治疗
[0198] 免疫治疗SNA(即，AST-008)提供了一种新颖的和通用的技术平台。其多价免疫调 节剂递送优化应答，而在淋巴瘤模型中已观察到显著肿瘤减少。此外，与游离寡核苷酸或明 矾相比，它们引发体内更高的有效的和均衡的T细胞应答。SNA可以使治疗性疫苗抗原和佐 剂在单一纳米颗粒上共存，并且，与游离免疫刺激CpG寡脱氧核苷酸相比，具有增强的活性 和更快的动力学。此外，SNA具有同时靶向多个免疫刺激性受体的潜力（例如TLR 3，4，7/8， 9)。它们可以被用于，例如，癌症免疫治疗和疫苗(预防性或治疗性）。
[0199] 免疫治疗5财以51'-008)简图被示于图15。5财可以使治疗性疫苗抗原和佐剂在单 一纳米颗粒上同时存在，并且可同时靶向多个免疫刺激受体(例如TLR 3,4,7/8,9)。
[0200] 在图16中示出，示范AST-008如何可以通过触发细胞内吞作用而进入内体的的简 图。AST-008-旦处于内体中，则可以用于通用的免疫系统刺激。在内体中，AST-008通过TLR 9受体(SNA疗法的分子靶标)刺激免疫系统信号传导，导致先天性和适应性免疫应答。AST-008 也可 以靶向 TLR 3 ， 4 ， 7/8 ， 导致先天性和适应性免疫应答。
[0201 ]与体外相应的CpG寡脱氧核苷酸(oligo)相比，AST-008诱导更高的促炎性应答。进 行了证明这一发现的测定。该数据被显示为在图17A和17B中的一组图表。图17A示出了由 CTL oligo，CTL SNA，CpG 1826和AST-008诱导的TNF，IL-12,和IL-6的表达水平。图 17B给出 了从指定试剂所产生的NF-kB活化。
[0202] AST-008在单一皮下剂量给药后还靶向引流淋巴结。AST-008被银染以增强金核心 的光散射，然后用曙红复染。使用4X亮场的放大倍率。数据示于图18。
[0203]本发明的结构适用于刺激体内强大的免疫应答。例如，图19是示出AST-008的体内 活性的曲线图。小鼠被给予5.1纳摩尔溶液(431'-008-?〇，六31'-008-?8,0?6 1826-?〇，〇?6 1826-ps，GpC-poSNA，GpC-ps SNA，GpC-po，或GpC-ps)的50yL推注尾静脉（静脉内）注射，然 后在注射后1，3和6小时分析IL-12表达(每组24只小鼠，每个时间点3只）<JL-12水平被表示 为相对于的倍数。相对于游离寡脱氧核苷酸，AST-008结构增强IL-12的诱导大约20倍， 在初始给药后效果持续超过六小时。图20A-20C由一对图形和图表组成，所述图形和图表显 示，与明矾或CpG寡核苷酸相比，AST-008诱导平衡的Thl/Th2应答（图20A)和较高的IgG2a抗 体（图20B)应答。结果被列表于图20(：。*叶〈0.01。图21六-218显示，与明矾或0?6寡核苷酸相 比，AST-008更有效地诱导细胞应答。图21A示意性地表示方案:使脾细胞生长28天，在第0天 与第21天进行攻击，然后采用SIINFEKL再刺激，和用ELISP0T在第28天探查INF-□。图21B是 描绘结果的图。林林P〈〇 · 0001。
[0204] 结构已被证明也产生体内显著抗肿瘤应答。图22A-22B表明，AST-008在体内淋巴 瘤模型中诱导显著肿瘤清除免疫应答。图22A示出方案:C57BL/6小鼠的右侧肋被注射IX 106E.G7-0VA淋巴瘤(每组11个）。然后采用100微克(yg)OVA皮下(s. c.)，1.8微克0VA257-264皮 下和AST-008中的0.92纳摩尔(nmol )〇 1 igo对小鼠进行三次攻击，并且以2000立方毫米处死 小鼠。图13B是结果的曲线图。*p〈0.05，使用双因素 AN0VA。图23A-23B显示，AST-008表现出 比CpG寡脱氧核苷酸优异的抗肿瘤活性和更长的生存。这些图显示，在C57BL/6小鼠在其右 侦_(每组11只）被注射1X10 6E.G7-0VA淋巴瘤、然后用PBS，PBS和0VA，CpG 1826和0VA，或 AST-008和0VA攻击三次后的肿瘤体积（图23A)和存活百分比（图23B)。吨〈0.05。
[0205] 表1:符号的注释 [0206]
[0207]
[C
[0209] 小写表示硫代磷酸酯键
[0210] 大写表示磷酸二酯键
[0211] 前缀"Ctrl"表示在没有CpG基序存在的情况下使用oligo
[0212] /iSpl8/内部间隔体-18
[0213] /3ThioMC3_D/端巯基
[0214] 参考文献
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[0227] 等价物
[0228] 本领域技术人员将认识到（或者能够使用不超过常规实验确定)本文中所述的本 发明的特定实施方案的许多等价物。这样的等价物旨在由以下权利要求书所涵盖。
[0229] 本文中所公开的所有参考文献(包括专利文件)被通过引用全文并入。
【主权项】
1. 纳米级构建体，其包含： 核酸相互作用复合物的激动剂的冠部，其中所述核酸相互作用复合物的激动剂的表面 密度为至少0 · 3pmol/cm2〇2. 纳米级构建体，其包含： 核酸相互作用复合物的激动剂的冠部，以及被并入所述冠部的抗原，其中所述抗原的 表面密度为至少0 · 3pmol/cm2〇3. 权利要求2所述的纳米级构建体，其中所述抗原包括至少两种不同类型的抗原。4. 纳米级构建体，其包含： 并入了核酸相互作用复合物的至少两种激动剂的冠部，其中所述激动剂选自由TLR 3、 7/8和/或9的激动剂组成的组。5. 权利要求1-4任一项所述的纳米级构建体，其中所述核酸相互作用复合物的激动剂 含有间隔子。6. 权利要求1-5任一项所述的纳米级构建体，其中所述核酸相互作用复合物的激动剂 是RNA或DNA。7. 权利要求6所述的纳米级构建体，其中所述核酸相互作用复合物的激动剂是双链 RNA〇8. 权利要求7，其中，所述双链RNA是聚（I:C)。9. 权利要求6所述的纳米级构建体，其中所述核酸相互作用复合物的激动剂是单链 RNA〇10. 权利要求9所述的纳米级构建体，其中所述单链RNA包含UUG-基序。11. 权利要求6所述的纳米级构建体，其中所述核酸相互作用复合物的激动剂为未甲基 化的脱氧核糖核酸。12. 权利要求11所述的纳米级构建体，其中所述未甲基化的脱氧核糖核酸是CpG寡核苷 酸。13. 权利要求1-12任一项所述的纳米级构建体，其中所述纳米级构建体在冠部的中心 含有纳米颗粒核心，所述纳米颗粒核心是金属的。14. 权利要求13所述的纳米级构建体，其中金属核心选自由金、银、铂、铝、钯、铜、钴、 铟、镍及其混合物组成的组。15. 权利要求13所述的纳米级构建体，其中所述纳米颗粒核心包含金。16. 权利要求1-16任一项所述的纳米级构建体，其中所述纳米级构建体是可降解的。17. 权利要求1-16任一项所述的纳米级构建体，其中所述纳米级构建体的直径是平均 直径lnm至大约250nm、平均直径大约lnm至大约240nm、平均直径大约lnm至大约230nm、平均 直径大约lnm至大约220nm、平均直径大约lnm至大约210nm、平均直径大约lnm至大约200nm、 平均直径大约lnm至大约190nm、平均直径大约lnm至大约180nm、平均直径大约lnm至大约 170nm、平均直径大约lnm至大约160nm、平均直径大约lnm至大约150nm、平均直径大约lnm至 大约140nm、平均直径大约lnm至大约130nm、平均直径大约lnm至大约120nm、平均直径大约 lnm至大约llOnm、平均直径大约lnm至大约100nm、平均直径大约lnm至大约90nm、平均直径 大约lnm至大约80nm、平均直径大约lnm至大约70nm、平均直径大约lnm至大约60nm、平均直 径大约lnm至大约50nm、平均直径大约lnm至大约40nm、平均直径大约lnm至大约30nm或者平 均直径大约1 nm至大约20nm或者平均直径大约1 nm至大约1 Onm。18. 纳米级构建体，其包含： 核酸相互作用复合物的激动剂的冠部，其中所述激动剂是具有至少一个核苷酸间磷酸 ^?醋键的核酉支。19. 权利要求18所述的纳米级构建体，其中所述激动剂是CpG寡核苷酸。20. 权利要求18-19任一项所述的纳米级构建体，其中所述核酸的每个核苷酸间键是磷 酸二酯键。21. 权利要求1-20任一项所述的纳米级构建体，其中所述冠部是球形冠部。22. 包含权利要求1-21任一项的纳米级构建体和载体的疫苗。23. 用于向细胞递送治疗剂的方法，其包括向所述细胞递送权利要求1-21任一项所述 的纳米级构建体。24. 用于调控靶分子的表达的方法，其包括向细胞递送权利要求1-21任一项所述的纳 米级构建体。25. 权利要求24所述的方法，其中所述靶分子是选自由TLR3、7、8和9组成的组的TLR。26. 用于活化TLR的方法，其包括向细胞递送权利要求1-21任一项所述的纳米级构建 体。27. 治疗受试者的方法，其包括 向所述受试者施用有效量的权利要求1-21任一项所述的纳米级构建体以刺激免疫应 答。28. 权利要求27所述的方法，其中所述受试者患有感染性疾病。29. 权利要求27所述的方法，其中所述受试者患有癌症。30. 权利要求27所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。31. 权利要求27所述的方法，其中所述受试者患有变态反应。32. 权利要求27所述的方法，其中所述受试者患有变应性疾病。33. 诱导受试者中免疫应答的方法，其包括 向所述受试者施用有效量的权利要求18-21任一项所述的纳米级构建体以刺激免疫应 答。
【专利摘要】本发明的方面涉及球形以核酸为基础的建体及其相关方法和组合物。本发明的组合物适用于激活核酸相互作用复合物的激动剂，如TLRs，刺激免疫应答，和治疗疾病，例如感染性疾病，癌症，变态反应，变应性疾病，和自身免疫性疾病。
【IPC分类】A61K31/7088, A61K9/14, B82Y5/00, C12N15/117
【公开号】CN105579582
【申请号】CN201480052001
【发明人】A·F·拉多维克-莫雷诺, C·C·马德尔, S·纳拉加特拉, W·哈桑, A·拉夫, S·格利亚兹诺夫
【申请人】埃克西奎雷股份有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年7月25日
【公告号】CA2919268A1, EP3024936A1, US20160186178, WO2015013673A1