未经处理的核酸样本的直接量化的制作方法
【专利说明】未经处理的核酸样本的直接量化
【背景技术】
[0001]对DNA技术用于解决案件的能力的认可增加已经显著增加对DNA分析的需求。过去 仅在暴力犯罪(如他杀和性侵犯）中收集DNA证据的执法机构已经开始收集来自财产犯罪案 件的DNA证据来辅助其侦查。然而，来自财产犯罪的生物学证据样本大多是触碰DNA样本。不 同于血液或唾液污渍，触碰DNA并非总是可由肉眼识别的。在许多情况下，执法人员在犯罪 现场用拭子擦拭其认为已由作案者触碰的表面或收集其认为曾与作案者物理接触的证物。 因此，可理解，以这种方式收集的一些样本可能完全不含有任何DNA。即使当在拭子上收集 作案者DNA时，无法保证其将含有足以获得可提供证据的DNA图谱的DNA。
[0002] 取决于犯罪性质，法医案件可以包括多个血液、唾液污渍以及触碰DNA样本。尽管 短串联重复(short tandem repeat;STR)DNA图谱分析技术极强大，但其对处理个案样本也 是昂贵、费时并且劳动密集的。对不含有足够DNA的样本进行完整STR DNA分型分析是对已 经有限的法医实验室资源的巨大浪费。
[0003] 法医样本的实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction;rtPCR) 量化原先包括于DNA图谱工作流程中以确保在DNA图谱分析中所采用的多重PCR中使用最佳 量的DNA。最先进的可供使用的实时量化分析还提供关于性别、男性/女性DNA量比率、预期 的可能PCR抑制程度和DNA降解水准的信息。rtPCR量化分析的极端敏感性还允许识别不具 有足以用于DNA图谱分析的DNA的样本。
[0004] 可供使用的实时量化分析输入的是假定DNA样本的等分试样，所述DNA样本已经进 行过提取和纯化程序。这些程序限制实时量化分析作为筛选工具的任何价值，因为当准备 好将样本用于实时量化分析时，大量时间和资源已经耗费在提取和纯化样本上，其可能不 具有任何可提供证据的价值。
[0005] 因此，在本发明之前，所属领域中需要能够识别将可提供证据的样本的简单、快 速、便宜并且稳健的分析。本发明传授用于在不需要先前提取和纯化的情况下分析样本可 提供证据的价值的方法。这些传授内容代表法医科学的显著进步。
【发明内容】
[0006] DNA量化在法医DNA分析所有应用中起中心作用。法医DNA分析常常涉及同时分析 存在于核DNA中的多个STR。在许多情况下，这通过利用多重聚合酶链反应（Polymerase Chain Reacti〇n;PCR)来实现。多STR的平衡扩增允许极不连续的输入DNA浓度窗，因此潜在 说明在STR扩增之前进行DNA量化的重要性。
[0007] 在本发明之前，用于量化分析中的输入DNA使用多种方法从其来源中进行提取。这 些方法包括Chelex?提取、苯酚/氯仿、二氧化硅膜、二氧化硅涂布的珠粒、离子交换膜以及 具有离子表面的磁珠。使用这类方法的问题包括DNA样本损失和其是费力的。
[0008] 本文公开一种用于在不先前应用提取技术的情况下对核酸的存在进行直接量化 的方法，所述方法涵盖将固体载体存放到容器中，在所述容器内进行PCR以及检测从所述容 器发射的荧光水准，其中所述荧光水准通过电荷耦合装置(Charge-coupled Device;CCD) 来加以检测。在一些实施例中，固体载体是纸张。在一些实施例中，固体载体是滤纸。
[0009]在一些实施例中，PCR是两步PCR，其中粘接和延伸温度相同。
【附图说明】
[0010] 图1展示5mm PE拭子。
[0011 ]图2展示拆开的5mm PE拭子，其显示三个PE拭子部件;滤纸条、固定器和夹子，以及 使用Harri s Uni-Core?冲孔器(punch)从PE拭子的取样面积产生的两个2mm冲孔。
[0012] 图3(A-D)展示在rtPCR期间，使用具有指定直径的圆形滤纸冲孔在不添加核酸模 板的情况下在不同染料通道中收集的荧光信号。也包括无滤纸对照(无冲孔）。
[0013] 图4展示滤纸冲孔大小和基线起点/终点设定对内部PCR对照（Internal PCR Control; IPC)CT值测定的作用。在这种情况下，IPC合成DNA序列存在于rtPCR反应混合物 中。在不添加核酸的情况下对每一个含有指定直径的滤纸的反应进行三次重复测试，同时 对无滤纸对照进行四次重复反应。
[0014] 图5展示存在于各种衬底上的干血渍：（A)水泥；（B)粗斜纹棉布1; (C)粗斜纹棉布 2; (D)黑色皮革；以及(E)棕色皮革。
[0015]图6展示对在20mm PE拭子上收集的未经处理的血渍进行直接rtPCR量化的结果。 使PE拭子与指定衬底接触，并且对从所述PE拭子取得的0.5mm冲孔直接进行rtPCR。NTC(无 模板对照）。
[0016] 图7展示对未经处理的触碰DNA样本的直接rtPCR量化。触碰DNA以从5mm PE拭子取 样面积产生的0.5_纸张冲孔的形式引入rtPCR中。
[0017] 图8展示在如通过直接量化所测定的输入DNA量与对应的STR图谱平均峰值高度之 间的相关性，所述STR图谱由对从相同PE拭子取得的冲孔进行直接扩增而获得。使用28个 PCR循环。
[0018] 图9展示STR图谱的颜色内平衡，所述STR图谱基于使用通过对来自各种指定衬底 的干血渍进行直接量化而测定的DNA量来获得。
[0019] 图10(A-D)展示从触碰DNA样本获得的STR图谱的结果，其中用于STR分析的输入 DNA量通过对PE拭子冲孔进行直接量化来加以测定。
[0020] 图11展示在基于直接量化的DNA输入与对应的STR图谱平均峰值高度之间的相关 性，所述STR图谱由对来自相同PE拭子的冲孔进行直接STR扩增而获得。使用30个PCR循环。
【具体实施方式】
[0021] 核酸可以使用聚合酶链反应(PCR)通过检测在PCR结束时（终点定量PCR)或在PCR 期间（实时PCR(rtPCR))存在的扩增产物来加以量化。在rtPCR中，焚光染料一般用于在热循 环期间标记PCR产物。这允许在扩增指数期期间；在限量试剂或聚合酶失活已经开始对PCR 扩增效率起作用之前基于荧光信号强度进行模板量化。
[0022] 在指数期中，荧光强度随每一个扩增循环按比例增加。主导思路曾是不透明材料 可能遮蔽荧光信号，并且因此应将其从rtPCR反应排除。
[0023] 与此对比并且如本文所公开的，现在展示固体载体（如滤纸）可以成功地并入 rtPCR中。这与标准rtPCR方案显著不同，在所述标准rtPCR方案中，提取核酸离开固体载体， 并且将不含固体载体的这种经过提取的核酸作为衬底引入以用于rtPCR。
[0024] 在法医学中，举例来说，使认为曾由嫌疑犯触碰的物品与滤纸接触以收集由所述 嫌疑犯留在所述物品上的任何残余核酸。在rtPCR之前，对滤纸进行用于从滤纸移出任何核 酸的提取技术。随后将所得经过提取的核酸引入rtPCR中以用于量化，同时单独丢弃滤纸。 这不同于本发明，在本发明中，将固体载体(如滤纸)直接引入rtPCR中。本文所公开的这种 新方法被称为"直接量化"。
[0025] 因此，在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容 器中，在所述容器内在所述固体载体存在下进行PCR，以及在PCR进行时检测从所述容器发 射的荧光水准，其中所述荧光水准通过电荷耦合装置来加以检测。在一些实施例中，检测到 的荧光水准与存在的核酸量有关。
[0026] "固体载体"是指核酸可以附着的任何固体表面。在一些实施例中，固体载体是不 透明的。
[0027] 因此，在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容 器中，在所述容器内在所述固体载体存在下进行PCR，以及在PCR进行时检测从所述容器发 射的荧光水准，其中所述荧光水准通过电荷耦合装置来加以检测，并且所述固体载体是不 透明的。
[0028] 在一些实施例中，固体载体的表面积与直径为约3mm的圆形的表面积大致相同。在 一些实施例中，固体载体的表面积与直径为约2_的圆形的表面积大致相同。在一些实施例 中，固体载体的表面积与直径为约1mm的圆形的表面积大致相同。在一些实施例中，固体载 体的表面积与直径为约0.7 5mm的圆形的表面积大致相同。
[0029] 在一些实施例中，固体载体形状大致是直径为约3mm的圆形，有时被称为冲孔。在 一些实施例中，固体载体形状大致是直径为约2mm的圆形。在一些实施例中，固体载体形状 大致是直径为约1mm的圆形。在一些实施例中，固体载体形状大致是直径为约0.75mm的圆 形。
[0030] 在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容器中， 在所述容器内进行PCR，以及检测从所述容器发射的荧光水准，其中所述荧光水准通过电荷 耦合装置来加以检测，其中所述固体载体是纸张。
[0031] "纸张"是指含有纤维素纤维的片材状块状物和模制产品。纤维素纤维可以包括来 自软木(来源于针叶树）、硬木(来源于落叶树)或棉籽绒的蒸煮纤维。也可以采用来自茅草 (Esparto grass)、甘鹿渣、粗毛(kemp)、亚麻以及其它木质和纤维素纤维来源。
[0032] 在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容器中， 在所述容器内进行PCR，以及在PCR进行时检测从所述容器发射的荧光水准，其中所述荧光 水准通过电荷耦合装置来加以检测，其中所述固体载体是滤纸。在一些实施例中，滤纸是 Whatman 903。在一些实施例中，滤纸是Ah 1 strom级别226。在一些实施例中，滤纸是 Munktell TFN〇
[0033] 在一些实施例中，在将滤纸存放到容器中之前，将弱碱吸收到所述滤纸中。"弱碱" 是指pH为约6到10,优选地约pH 8到9.5的碱。