微生物的检查方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物的检查方法，特别涉及用于同时迅速地检测多种微生物的 检查方法。
【背景技术】
[0002] 以往，在食品制造现场或临床现场、以及文物等的保护环境等中，检查是否存在有 霉菌等微生物、确认安全性、并且防止其繁殖十分重要。
[0003] 作为此种以微生物、特别是霉菌作为对象的检查方法，可以举出以下所示的3种方 法。
[0004] 首先，作为第一方法，可以举出如下的方法，即，从环境中采集试样而进行前培养 (所采集的菌的同时培养），然后，在对每个菌种最佳的培养基中进行20天左右的培养后，观 察形态的特征，由此来鉴定微生物，进行其存在与否的确认(参照专利文献1)。
[0005] 另外，作为第二方法，可以举出如下的方法，即，从环境中采集试样而进行前培养 后，对各菌进行单独培养，从培养细胞中提取DNA，利用PCR(聚合酶链式反应)法扩增靶区 域，分析该区域的碱基序列，由此进行微生物的鉴定及存在确认。
[0006] 此外，作为第三方法，可以举出如下的方法，即，制成包含与靶区域互补地结合的 碱基序列的探针并固定化在DNA芯片的基板上，将借助PCR法的扩增产物滴加至DNA芯片，使 靶区域与探针杂交，进行试样中所含的微生物的鉴定及存在确认(参照专利文献2)。
[0007] 基于形态进行微生物的鉴定的第一方法需要在进行前培养而生长后单独地进行 培养。此时为了表达微生物的形态的特征，需要对每个菌种准备最佳的培养基并进行长时 间的培养，因此根据微生物种类会需要长达50天左右的检查期间。另外，在微生物的鉴定时 需要熟练，因此不适于迅速的检查或简易的检查。
[0008] 在借助序列分析的第二方法中，也需要在前培养后对每个菌种单独进行培养。因 此，作为检查期间需要14天左右。另外，由于是对每个菌种单独进行分析的方法，因此不适 于需要同时检查多个样品的情况。
[0009] 另一方面，在使用DNA芯片的第三方法中，可以不用对每个菌种单独进行培养地检 测微生物，能够将检查期间缩短到9天左右。
[0010] 然而，迫切期望使检查进一步加速，也就是在检查现场，在从环境中采集试样的当 天之中即想要知道其结果。
[0011]但是，在使用DNA芯片的第三方法中也需要前培养，该前培养需要7天左右，因此第 三方法无法响应该要求。
[0012] 此处，提出过能够不进行前培养地实施使用了 DNA芯片的微生物的检查的、用于微 小有机体的迅速的检测的方法(参照专利文献3)。
[0013] 专利文献1:日本特开2007-195454号公报 [0014] 专利文献2:日本特开2008-35773号公报 [0015] 专利文献3:日本特开2007-508811号公报
【发明内容】
[0016] 发明所要解决的问题
[0017] 然而，该用于微小有机体的迅速检测的方法是从微生物中提取RNA的方法，在微生 物为孢子形态的情况下，无法获得RNA。另一方面，无法选择性地捕集非孢子形态的微生物， 因此存在有需要用于使孢子发芽的恢复工序的问题。
[0018] 另外，为了能够不进行RNA或与之互补的DNA的扩增地检测微生物，需要捕集数量 非常多的微生物的细胞（实施例中使用百万个细胞。在比较肮脏的环境下，取样需要数 天。），存在有难以缩短包括取样在内的整个检查的期间的问题。
[0019] 本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于，提供一种能够进一步缩短包括取 样在内的整个检查的期间的微生物的检查方法。
[0020] 用于解决问题的方法
[0021] 为了达成上述目的，本发明的微生物的检查方法是同时判定环境中是否存在多种 微生物的微生物的检查方法，具有:采集工序，将飘浮于空气中的微生物回收到液体中；核 酸提取工序，从液体中的微生物中提取核酸；核酸扩增工序，将所提取的核酸的一部分扩 增;和检测工序，将含有经过扩增的核酸的溶液滴加到预先固定化有多种微生物的核酸的 载体中，在与经过扩增的核酸互补地结合的核酸被固定化在载体上的情况下，鉴定微生物 的种类，在采集工序之后、且核酸提取工序之前，不进行微生物的培养。
[0022]发明效果
[0023]根据本发明，可以提供能够进一步缩短包括取样在内的整个检查的期间的微生物 的检查方法。
【附图说明】
[0024]图1是表示实施例的空气采样器所回收的空气量与霉菌数的关系的图表。
[0025]图2是表不实施例中使用的引物的喊基序列的图表。
[0026 ]图3是表不实施例中使用的探针的喊基序列的图表。
[0027] 图4是表示实施例的借助DNA芯片的检测结果(S/N比）的图表。
【具体实施方式】
[0028] 以下，对本发明的优选的实施方式进行详细说明。
[0029] 本发明的实施方式的微生物的检查方法是同时判定环境中是否存在多种微生物 的微生物的检查方法，其特征在于，具有:采集工序，将飘浮于空气中的微生物回收到液体 中；核酸提取工序，从液体中的微生物中提取核酸;核酸扩增工序，将所提取的核酸的一部 分扩增;和检测工序，将含有经过扩增的核酸的溶液滴加到预先固定化有多种微生物的核 酸的载体中，在与经过扩增的核酸互补地结合的核酸被固定化在载体上的情况下，鉴定微 生物的种类，在采集工序之后、且核酸提取工序之前，不进行微生物的培养。
[0030] 本实施方式的微生物的检查方法可以包括以下的工序。
[0031] (!)采集工序
[0032] 采集工序中，将飘浮于空气中的微生物回收到液体中。此时，作为用于回收微生物 的取样装置，优选使用气旋式的空气采样器。另外，作为液体，为了提高微生物的回收效率， 优选使用含有表面活性剂的液体。
[0033]通过使用气旋式的空气采样器，空气被高速地以螺旋状取入取样容器的液体中后 排出，在该过程中空气中的微粒因离心力而附着于取样容器的内壁。由此，就可以将空气中 的微生物回收到取样容器的液体中。
[0034]作为气旋式的空气米样器，例如可以合适地使用Coriolis μ(液相离心分离法式： 液体气旋，Bertin公司制）。
[0035]在使用气旋式的空气采样器的情况下，优选以300L/分钟的流速进行1~10分钟空 气的抽吸。
[0036]通过像这样在采集工序中使用气旋式的空气采样器，就可以在短时间内从大量的 空气中将比较多的微生物回收到液体中。因此，即使在核酸提取工序之前不进行微生物的 培养(前培养），也可以在核酸扩增工序中充分地扩增微生物的核酸，可以在检测工序中检 测该微生物。
[0037] 另外，由于不需要进行微生物的前培养，因此也可以降低由于培养基的条件的原 因而无法恰当地生长微生物、从而无法检测该微生物的风险。
[0038] 在本实施方式的微生物的检查方法中，"微生物"中包括霉菌或酵母等真菌、食物 中毒菌等细菌、以及其他的不使用显微镜就无法看到的微小的生物。
[0039] 特别是，根据本实施方式的微生物的检查方法，可以恰当地检测在食品检查、流行 病学的环境检查、环境检查、临床试验、及家畜卫生等中重要的飘浮于空气中的胞子或菌丝 形态的霉菌。
[0040] 另外，由于不需要进行微生物的培养，因此不仅可以从活的微生物，而且还可以从 死菌等微生物的残骸，来鉴定该微生物的种类。
[0041 ] (2)核酸提取工序
[0042]核酸提取工序中，从采集工序中得到的液体中的微生物中提取核酸。由此，就可以 从微生物中获得基因组DNA。核酸的提取可以利