PCR法 扩增。
[0078] 此时，作为检测对象的霉菌，选择了帚状曲霉(Aspergillus penicillioides)、枝 抱霉（Cladosporium sp·)、以及耐盐真菌（Wallemia sebi)〇
[0079] 此后，如图2所示，作为用于将这3种霉菌的基因组DNA中的ITS区域扩增的引物组， 使用了序列号1中所示的正向引物及序列号2中所示的反向引物。另外，作为用于将帚状曲 霉的基因组DNA中的β-微管蛋白区域扩增的引物组，使用了序列号3中所示的正向引物及序 列号4中所示的反向引物。
[0080]作为PCR反应液，使用了Ampdirect (R)(株式会社岛津制作所制），对每个样品制成 20μ 1的下面的组成的反应液。
[0081] l.Ampdirect addition(G/Crich) 4·0μ1
[0082] 2.Ampdirect(addition-4) 4·0μ1
[0083] 3.dNTPmixture Ι.ΟμΙ
[0084] 4.1.0mM Cy5-dCTP 0.2μ1
[0085] 5.HS1区域扩增用正向引物(2.5μΜ，序列号1，由Sigma Aldrich公司合成）Ι.ΟμΙ
[0086] 6. HS1区域扩增用反向引物(2.5μΜ，序列号2,由Sigma Aldrich公司合成）Ι.ΟμΙ
[0087] 7.β-微管蛋白区域扩增用正向引物(ΙΟμΜ，序列号3,由Sigma Aldrich公司合成）Ι.ΟμΙ
[0088] 8.β-微管蛋白区域扩增用反向引物(ΙΟμΜ，序列号4,由Sigrn Aldrich公司合成）Ι.ΟμΙ
[0089] 9.Nova Taq Hot Start DNA polymerase 0.2μ1
[0090] 10.试样的基因组DNA Ι.ΟμΙ
[0091] 11.水(加水至整体为20. ΟμL为止）
[0092] 使用该PCR反应液，利用核酸扩增装置(TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(R) Gradient TAKARA BIO株式会社制），对每个样品在下面的条件下进行了DNA的扩增。
[0093]
[0094]然后，在检测工序中，对每个样品使用了固定化有帚状曲霉检测用的探针、枝孢霉 检测用的探针、以及耐盐真菌检测用的探针的DNA芯片。作为DNA芯片，使用了Gene Silicon (R)(东洋钢钣株式会社制）。
[0095] 另外，如图3所示，作为帚状曲霉检测用的探针，使用包含序列号5、序列号6中所示 的碱基序列的探针，作为枝孢霉检测用的探针，使用包含序列号7中所示的碱基序列的探 针，作为耐盐真菌检测用的探针，使用包含序列号8中所示的碱基序列的探针。
[0096] 包含序列号5、序列号7、以及序列号8中所示的碱基序列的探针是与上述的用于扩 增ITS区域的引物组的扩增对象区域的一部分杂交的探针。另外，包含序列号6中所示的碱 基序列的探针是与上述的用于扩增微管蛋白区域的引物组的扩增对象区域的一部分杂 交的探针。
[0097]向基于PCR法的扩增产物中混合缓冲液(3 X SSC+0.3%SDS)，滴加至上述DNA芯片。 [0098] 将该DNA芯片在45°C静置1小时，用上述缓冲液将没有杂交的PCR产物从DNA芯片冲 掉。
[0099] 然后，将DNA芯片装在标记检测装置(Gene Silicon专用扫描仪BI0SH0T东洋钢钣 株式会社制）中，测定出各探针的荧光强度。将其结果表示于图4中。
[0100] 在同一图中，各数值表示S/Ν比（（荧光强度值-背景值)/背景值），如果为3以上，则 可以判断存在有对应的霉菌。另外，对于帚状曲霉，在针对ITS区域及β-微管蛋白区域双方 S/Ν比为3以上的情况下，可以判断存在有该霉菌，由此可以可靠地防止产生假阳性反应，可 以进行更高精度的检查。
[0101] 如图4所示，对于地点Α，通过样品1可以确认帚状曲霉的存在。另外，通过样品1-3 可以确认枝孢霉的存在，通过样品3可以确认耐盐真菌的存在。
[0102] 另外，对于地点B，通过样品4,可以确认帚状曲霉及枝孢霉的存在。
[0103] 如此所述，根据本实施方式的微生物的检查方法可知，可以不进行微生物的前培 养地检测该微生物。另外，取样所需的时间也只要10分钟左右即可，可以大幅度减少从微生 物的采集工序到检测工序的整个检查所需的期间。
[0104]其结果是，根据本实施方式的微生物的检查方法可知，可以在从环境中采集试样 的当日之中获得检查结果，可以使以往包括取样在内需要数天的微生物的检查大幅度加 速。另外，根据上述结果可知，在以换算霉菌数计为750以下、甚至为450以下、150以下、100 以下的数目时也可以进行检查。
[0105] 本发明并不受以上的实施方式、实施例限定，当然可以在本发明的范围内中实施 各种变更。
[0106] 例如，上述实施例中，仅以3种霉菌作为对象使用，然而本发明在其特征上，当然可 以不局限于微生物的种类地应用，可以将同样的方法用于其他的种类的霉菌或其他的微生 物的检测等，适当地进行变更。
[0107] 产业上的可利用性
[0108] 本发明可以适用于食品检查、流行病学的环境检查、环境检查、临床试验、以及家 畜卫生等同时检查多种霉菌的情况。
【主权项】
1. 一种微生物的检查方法，是同时判定环境中是否存在多种微生物的微生物的检查方 法，其特征在于， 具有： 采集工序，将飘浮于空气中的微生物回收到液体中； 核酸提取工序，从所述液体中的所述微生物中提取核酸； 核酸扩增工序，将所述所提取的核酸的一部分扩增；以及 检测工序，将含有所述经过扩增的核酸的溶液滴加到预先固定化有多种微生物的核酸 的载体中，在与所述经过扩增的核酸互补地结合的核酸被固定化在所述载体上的情况下， 鉴定所述微生物的种类， 在所述采集工序之后、且所述核酸提取工序之前，不进行所述微生物的培养。2. 根据权利要求1所述的微生物的检查方法，其特征在于， 所述微生物为孢子或菌丝形态的霉菌。3. 根据权利要求1或2所述的微生物的检查方法，其特征在于， 所述微生物中包含微生物的残骸， 在所述检测工序中，鉴定作为残骸的所述微生物的种类。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的微生物的检查方法，其特征在于， 在所述采集工序中，使用空气采样器，回收300~3000L的空气，将飘浮于所回收的空气 中的微生物回收到液体中。
【专利摘要】本发明提供一种微生物的检查方法，能够进一步缩短包括取样在内的整个检查的期间。本发明是同时判定环境中是否存在多种微生物的微生物的检查方法，具有：采集工序，将飘浮于空气中的微生物回收到液体中；核酸提取工序，从液体中的微生物中提取核酸；核酸扩增工序，将所提取的核酸的一部分扩增；以及检测工序，将含有经过扩增的核酸的溶液滴加到预先固定化有多种微生物的核酸的载体中，在与经过扩增的核酸互补地结合的核酸被固定化在载体上的情况下，鉴定微生物的种类，在采集工序之后、以及核酸提取工序之前，不进行微生物的培养。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/09, G01N1/02
【公开号】CN105637101
【申请号】CN201480056925
【发明人】大津贵义, 一色淳宪
【申请人】东洋制罐集团控股株式会社
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月16日
【公告号】WO2015059907A1