件相对于双分子杂交在动力学上有利。Scorpion探针包含具有附 着探针尾部序列的引物，其中所述探针序列含于类似于分子信标二级结构的茎-环二级结 构内。在非延伸形式中，Scorpion引物由于焚光团和淬灭剂部分极为接近而为非焚光的。在 PCR期间，Scorpion的引物组分在其3'端延伸，生产探针杂交所需的同源目标序列。当 Scorpion探针序列与经扩增目标杂交时，荧光团和淬灭剂部分变为在空间上分离的，产生 与目标扩增同时发生的荧光信号显著增加。
[0090] 在rtPCR分析中可以检测多种荧光染料，并且所述荧光染料可以包括(但不限于） 以下:5_羧基荧光素或6-羧基荧光素(FAM?)、VIC?、NED?、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、 IRD-700/800、花青染料（如 CY3TM、CY5TM、CY3·5TM、CY5·5TM、Cy7 TM)、二苯并哌喃（xanthen)、6-羧基-2'，4'，7'，4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-l，4-二氯-2'，7'-二氯-荧光素（TET?)、 6-羧基-4'，5'_二氯-2'，7'_甲氧基荧光素（J0E?)、N，N，N'，N'_四甲基-6-羧基罗丹明 (TAMRA?)、6-羧基-X-罗丹明（R0X)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹 明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、Rhodamin6G?、B0DIPY染料（如B0DIPY TMR)、俄勒冈 绿、香豆素（如伞酮（觀6611丨化1'〇116))、苯甲酰亚胺（如!1〇6〇118七33258);啡啶（如16叉已8 Red?、Ca 1 iforniaRed?、Yakima Ye 1 low、Alexa.Fluo.r?350、AlexaFl.u〇r_405、Alexa Fluor? 430、AlexaFluor? 488、AlexaFluor? 500、Alexa Fluor? 514、Alexa.Fluor?.532、 Ak'xaHuorl? 5 46、AlexaF丨uor? 555、Ak'xa F丨uor? 568、Alc'xa Huor? ；594、/\ I L'xa Fluor?": 610、Alexa Fluor? 633、Alexa Fluor?. 647、Alexa Fluor? 660、A1 exaFlu.or?.680、Alexa Fluor? 700、AlexaFluor? 750、PET? )、溴化乙锭、吖锭染料、P掷坐染料、吩噁嗪染料、紫菜 喊染料、聚甲块染料、Atto 390、Atto 425、Atto 465、Atto 488、Atto 495、Atto 520、Atto 532、Atto 550、Atto 565、Atto 590、Atto 594、Atto 620、Atto 633、Atto 647N、Atto 655、 Atto RhoG6、Atto Rhol l、Atto Rhol2、Atto Rhol01、BMN?-5、BMNTM-6、CEQ8000 D2、 CEQ8000D3、CEQ8000D4、DY-480XL、DY-485XL、DY-495、DY-505、DY-510XL、DY-521XL、DY-521XL、DY-530、DY-547、DY-550、DY-555、DY-610、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、 DY-647、DY-651、DY-675、DY-676、DY-680、DY-681、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、 DY-750、DY-751、DY-776、DY-780、DY-781、DY-782、CAI,Fluor?*540、CALFlu〇d：C590、CAL Fluor 红 610、CAL Fluor 红 635、IRDyd::700Dx、IRDye3iH()()CW、Marina Blue'?、Pacific 13111〇/、丫&1<:;[1]1&丫611：〇观@、.6-(4,7 -二氣-2'，7'-二苯基-3'，6'-二新戊酉先基焚光素 -6-甲酉先 胺基)-己基-1-0-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(S頂A)、CALFluor?金540、CAL Fluor?澄560、CAL Fluor红635、Quasar 570、Quasar 670、LIZ、森尼韦尔红（Sunnyvale Red)、LC Red? 610、LC Red? 640、LC Red?670 以及LC Red:@705。
[0091] 在rtPCR期间从容器发射的荧光信号可以使用多种不同类型的检测器来加以检 测，包括电荷耦合装置(CCD)、光电二极管以及光电倍增管。CCD将其捕获的光转化成数字数 据。所捕获图像的品质由分辨率确定，通常以百万像素进行表述。CCD典型地用于捕获容器 或反应板的图像，随后由仪器软件解释其内容。
[0092] 光电二极管是一种类型的光探测器，其在暴露于光中时使电流流动。光电倍增管 使由入射光产生的电流倍增。
[0093] 因此，在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容 器中，在所述容器内进行rtPCR，以及在rtPCR进行时检测从所述容器发射的荧光水准，其中 所述荧光水准通过电荷耦合装置而非光电二极管或光电倍增管来加以检测。
[0094] 在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容器中， 在所述容器内进行rtPCR，以及在rtPCR进行时检测从所述容器发射的荧光水准，其中所述 荧光水准通过电荷耦合装置或光电二极管而非光电倍增管来加以检测。
[0095] 在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容器中， 在所述容器内进行多重rtPCR，以及在rtPCR进行时检测从所述容器发射的荧光水准，其中 所述荧光水准通过电荷耦合装置、光电二极管或光电倍增管来加以检测。
[0096] 在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容器中， 在所述容器内进行多重rtPCR，以及在rtPCR进行时检测从所述容器发射的荧光水准，其中 所述荧光水准通过电荷耦合装置或光电二极管而非光电倍增管来加以检测。
[0097] 在一些实施例中，公开一种以下方法，所述方法涵盖:将固体载体存放到容器中， 在所述容器内进行多重rtPCR，以及在rtPCR进行时检测从所述容器发射的荧光水准，其中 所述荧光水准通过电荷耦合装置而非光电倍增管或光电二极管来加以检测。
[0098] 实例
[0099] PE拭子样本收集器
[0100]用于收集分析用样本的PE拭子的一个实例描绘于图1中。通过围绕固定器缠绕滤 纸条来装配PE拭子，并且随后通过PE拭子把手末端的夹子将所述纸条紧固在固定器上。活 性取样区域的宽度由固定器的成角折叠来界定。在图1中所示的实例中，PE拭子在从活性取 样区域测量到拭子把手末端时是约40mm长。在这个实例中，活性取样区域是约5mm JE拭子 把手是约15mm宽。
[0101 ] 5mm PE拭子的活性取样区域是约ImmX5mm。在移出0·5mm冲孔之后，实际上可以由 5mm PE拭子的剩余活性取样区域产生四个1mm冲孔。
[0102] 在一些情况下，向表面施用液体以促进通过擦拭的样本收集。
[0103] 在擦拭之后，从固定器上拆下滤纸条。使用Harris Uni-C〇re?冲孔器(泰德佩拉公 司（Ted ?611&，111(3.))，从滤纸的活性取样区域产生所需大小的冲孔以用于直接实时?0? (rtPCR)分析或直接STR PCR。如果使用擦拭液体，那么在冲孔之前对滤纸进行干燥。
[0104] 冲孔大小和基线设定对rtPCR量化的作用
[0105] 因为用光照亮样本和检测荧光信号对rtPCR分析至关重要，所以预期反应孔 (reaction well)中滤纸冲孔的存在将对荧光信号的检测具有影响。为了测试冲孔大小对 rtPCR分析的影响，在rtPCR分析中测试各种直径(0.5mm、1mm以及2mm)的冲孔。由PE拭子产 生具有不同直径的个别冲孔，并且将其直接放置到MicroAmp?光学 96孔反应板的孔中。由 阴性对照PE拭子制得冲孔；阴性对照PE拭子也就是未用于擦拭表面的PE拭子。随后对冲孔 进行rtPCR分析。
[0106] 对于rtPCR分析，采用 Quamil'ilcr:丨？ Duo DNA量化反应试剂盒。Quantmkr.R:Duo DNA量化试剂盒被设计成用于同时量化样本中可扩增人类DNA和人类男性DNA的总量。The QimntifileriDDuo试剂盒含有两种用于扩增人类DNA(核糖核酸酶P RNA组分HI)的引物和一 种用于检测经扩增人类目标序列的标记有荧光染料VIC?的TaqMatl?小沟结合物(Minor Groove Binder;MGB)探针，两种用于扩增人类男性DNA(性别决定区Y)的引物和用于检测经 扩增人类男性目标序列的标记有荧光染料FAM?的TaqMan?MGB探针，以及两种用于扩增内 部PCR对照（IPC)模板(其是未在自然界中发现的充当阳性PCR对照的合成核苷酸序列）的引 物和用于检测经扩增IPC DNA的标记有荧光染料NED?的TaqMati?MGB探针。包括荧光染料 R0X?作为被动对照。
[0107] 为了分析冲孔和冲孔大小对rtPCR的影响，将各种大小的冲孔存放在MicroAmp? 光学96孔反应板的孔中。也分析没有冲孔的孔。祥每一个孔中添加10.5yLQuaiitime:r?Du〇 引物混合物、12.5yLQuantii'iier?Duo PCR反应混合物以及2yL去离子水。孔中也存在IPC模 板对照。在应用生物系统公司(Applied Biosystems)7500实时PCR系统上使用制造推荐方 案进行量化反应。应用生物系统公司7500实时PCR系统利用CCD检测器。使用SDS软件v2.0.6 (生命技术公司（Life Technologies))来分析量化结果。来自这个分析的结