明的方法中，优选生物忍片阵列技术系统(BAT)(可 获自Randox Laboratories Limi ted)。更优选地，可使用Evidence Evolution and Evidence Investigator仪器（可获自Randox Laboratories)来测定样品中生物标志物的 水平。
[0070] 在本发明相关的第S方面中，本发明第二方面所述的包含VCAM-I、GFAP和CRP的探 针的基底被用于本发明第一方面所述的用于协助鉴别诊断患者的出血性中风、缺血性中风 和短暂性脑缺血发作的方法中。
[0071] 根据第四方面，本发明设及VCAM-1、GFAP、CRP、IL-6和/或sTNFRl作为出血性中风 的生物标志物和/或作为出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的区分指标的用途。
[0072] 本发明也提供试剂盒，其包含VCAM-I、GFAP和CRP的探针，W及任选地IL-6和/或 sTNFRl的探针，另外的试剂，基底/反应表面和/或使用说明书。运样的试剂盒可被用来根据 本发明第一方面鉴别诊断患者的中风子类型。
[0073] 本发明将参考W下非限制性实施例进一步描述。 实施例
[0074] 患者组
[0075] 该研究由被希腊雅典的KAT总医院急诊室收治的98例显示中风症状的患者组成。 在收治时W及在第1、第2、第3和第7天抽取血液样品。中风症状的发作到医院收治之间的平 均时间是3.2小时。患者的平均年龄是75.2岁(标准误差9.4)。临床评估(使用背景部分强调 的标准)和神经成像技术鉴定44例缺血性中风(IS )、25例出血性中风化S )，29例短暂性脑缺 血发作(TIA) ;60位健康个体作为对照(C)。
[0076] 样品分析
[0077] 检验获自本研究组患者的血液的抓TA血浆样品中的W下蛋白：VCAM-I、GFAP、CRP、 IL-6和sTNFRl。使用并入生物标志物特异性抗体的多路生物忍片和Evidence Investigator(Randc)X Laboratories Ltd,Crumlin，UK)检测和定量所述蛋白。根据开发商 的说明书进行同时的免疫分析。分析每种生物标志物的9点标准曲线和=种参考对照W允 许结果的校验。对于CRP IS与TIA比较的分析，将样品稀释十倍。
[0078] 统计学分析
[0079] 将单个生物标志物应用于ROC曲线分析W评估敏感性和特异性。使用逻辑回归来 模拟中风和中风子类型与多种生物标志物组合的浓度的从属性，随后通过ROC曲线分析来 评估模拟的分类准确性。结果如图1 -3所示。
[0080] 性别与用于确定中风子类型的每一种生物标志物的相关性如图4-8所示。
[0081 ] 结果
[0082] 表3所示的数据显示使用本发明的生物标志物区分HS与IS/TIA。使用本发明的生 物标志物区分服与IS和TIA患者的ROC曲线分析如图3所示。
[0083] 表 3
[0084]
[0085] 此外，图1-3和表4示例了使用生物标志物的组合将所有中风患者归类为TIA、IS或 HS患者，在使用多项式逻辑回归的该实例中，得出超过任何单独生物标志物的改善区分。
[0086]
N ?s：
[0087]此外，设计归类算法的可选方法，如使用人工神经网络（参见图9和表5)显示相似 的性能特点。
[0088] 表 5
[0089] 曲线下的面积
[0090]
[0091] a.非参数假设下
[0092] b.零假设:真实面积= 0.5
[0093] 该表进一步示例了在通过本领域已知的任何方法导出的算法中组合目标生物标 志物的鲁棒性。
[0094] 缩写
[009引 GFAP-胶质纤维酸性蛋白
[0096] 比-6-白细胞介素-6
[0097] ICAM-I-细胞内粘附分子-1
[0098] VCAM-I-血管细胞粘附分子-1
[0099] CRP-C-反应蛋白
[0100] FABP-脂肪酸结合蛋白
[0101] sTNFRl-可溶的 TNFa 受体 1
[0102] k选择蛋白-淋己细胞细胞粘附分子(CD62L)
[0103] P-选择蛋白-血小板细胞粘附分子
[0104] D-二聚体-纤维蛋白降解产物
【主权项】
1. 协助鉴别诊断已患有或正患有中风的患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺 血发作的方法，其包括： i)测定获自所述患者的离体样品中生物标志物VCAM-1、GFAP和CRP的浓度；以及 i i)建立所述生物标志物的浓度的统计学意义。2. 如权利要求1所述的方法，其还包括： i i i)测定获自所述患者的离体样品中生物标志物IL-6和sTNFRl的浓度； iv) 确定所述患者的性别；以及 v) 与所述患者的性别结合，建立五种生物标志物的浓度的统计学意义。3. 如权利要求1或2所述的方法，其中将每种生物标志物的浓度值输入统计学算法以产 生输出值，所述输出值与出血性中风、缺血性中风或短暂性脑缺血发作的鉴别诊断相关。4. 如权利要求3所述的方法，其中所述方法被用来鉴别诊断出血性中风和缺血性中风/ 短暂性脑缺血发作。5. 如权利要求3或4所述的方法，其中所述统计学算法包括逻辑回归方程。6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者被诊断为正患有或已患有中 风。7. 如权利要求6所述的方法，其中所述患者通过以下步骤被诊断为已患有或正患有中 风:测定获自所述患者的离体样品中至少两种生物标志物的浓度，并且通过将每种生物标 志物的浓度值与相应的对照值比较，建立所述生物标志物的浓度的统计学意义，其中所述 至少两种生物标志物选自ICAM-1、L-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-l、IL-6、sTNFRl、D-二聚 体和CRP，并且其中两种生物标志物中至少一种选自ICAM-1、L-选择蛋白、P-选择蛋白和 VCAM-1，其中将患者和对照的每种生物标志物浓度值输入统计学算法以产生输出值，所述 输出值指示是否已发生中风。8. 如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆样品。9. 基底，其包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针，用于权利要求1-8中任一项所述的协助鉴别 诊断患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法。10. 如权利要求9所述的基底，其还包含IL-6和sTNFRl的探针。11. 如权利要求9或10所述的基底，其中所述基底具有固定在其上的探针。12. 如权利要求9至11中任一项所述的基底，其中所述基底为生物芯片。13. 包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针的基底在权利要求1至8中任一项所述的协助鉴别诊 断患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法中的用途。14. 如权利要求13所述的基底的用途，其中所述基底还包含IL-6和sTNFRl的探针。 15. VCAM-l、GFAP、CRP、IL-6和/或sTNFRl作为出血性中风的生物标志物和/或作为出血 性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的区分指标的用途。
【专利摘要】本发明提供协助鉴别诊断已患有或正患有中风的患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法。所述方法包括：(i)测定获自患者的离体样品中生物标志物VCAM-1、GFAP和CRP的浓度；以及(ii)建立所述生物标志物的浓度的统计学意义。任选地，所述方法还包括以下步骤：(iii)测定获自患者的离体样品中生物标志物IL-6和sTNFR1的浓度；(iv)确定所述患者的性别；以及(v)与所述患者的性别结合，建立五种生物标志物的浓度的统计学意义。本发明也提供基底，其包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针，用于协助鉴别诊断中风的方法。
【IPC分类】C12Q1/68, G01N33/68
【公开号】CN105705652
【申请号】CN201480031824
【发明人】伊凡·麦康内尔, 约翰·拉蒙特, 彼得·菲茨杰拉德, 康斯坦提诺斯·马克里斯
【申请人】兰道克斯实验有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年6月4日
【公告号】CA2913524A1, EP3004382A1, US20160139147, WO2014195698A1