长效化艾塞那肽(Exendin-4)类似物及其应用
【专利摘要】本发明涉及一类长效化艾塞那肽(Exendin?4)类似物及其合成方法。通过对Exendin?4进行改造得到具有更长药理作用时间的Exendin?4类似物，目标多肽的合成是通过微波促进固相合成方法快速实现，粗品经纯化，冻干得到Exendin?4类似物。
【专利说明】
长效化艾塞那肽(Exend i n-4)类似物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及糖尿病治疗领域的长效化艾塞那肽(Exendin-4)类似物及其应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾 病。目前，全球约有3亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至5亿。临床上采用胰岛素强化治 疗的方法来延缓糖尿病进程，胰岛素治疗在降低血糖的同时可以一定程度上逆转胰岛细 胞功能损害。但是使用胰岛素会出现低血糖的危险。受到剂量大小、注射部位、注射途径、个 体差异或注射后未进食等因素的影响，如果使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖 副作用。
[0003] 胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)是一种葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰 岛素分泌而不出现低血糖，这种葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌特性，避免了糖尿病治疗中 常存在的产生低血糖症的危险，这些生理功能使开发GLP-1作为一种2型糖尿病治疗药物具 有广阔的前景。
[0004] GLP-1主要由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖多肽 激素，通过作用于胰岛β-细胞膜上的受体GLP-1受体(GLP-1R)，促进胰岛素的分泌。此外， cAMP水平升高，又激活cAMP依赖的蛋白激酶Α和磷酸化酶，进而刺激β-细胞胰岛素基因的转 录和翻译，刺激细胞的增值和分化。
[0005] GLP-1具有多种生物学效应。如下：
[0006] 1、具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用；
[0007] 2、阻止胰腺β-细胞退化，刺激β-细胞的增值和分化；
[0008] 3、诱导前胰岛素基因的转录，促进前胰岛素的生物合成；
[0009] 4、增加胰岛素的敏感性；
[0010] 5、增加生长抑素分泌，抑制胰高血糖素的产生(此作用也是血糖依赖性）；
[0011 ] 6、抑制胃酸分泌，延迟胃排空；
[0012] 7、通过作用于丘脑下部的中枢抑制食欲，降低食物摄取量等作用。
[0013] 虽然天然GLP-1在治疗糖尿病上有以上诸多优点，但它在体内易被二肽基肽酶IV (DPP-IV)快速降解。DPP-IV可特异性识别GLP-1的Ν末端第二位丙氨酸(Ala)残基，从肽链Ν 末端第2位丙氨酸(Ala)处切除二肽，使其转变为无活性的形式，其体内半衰期仅5分钟左 右。GLP-1分子N端是与GLP-1受体的结合部位，其组氨酸残基丧失，导致GLP-1完全失去生物 活性。目前普遍使用的延长GLP-1体内半衰期的修饰策略包括对8位修饰使得GLP-1、能抵 抗DPP-IV酶的降解，将GLP-1肽链N端8位和9位的氨基酸互换可以达到此目的。短效GLP-1受 体激动剂Exendin-4和lixisenatide就是利用此方法进行修饰的典型代表。然而，由于多肽 还会在肾脏中快速滤过消除，抗DPP-IV酶的降解只能一定程度的延长GLP-1的半衰期。这 里，我们在短效GLP-1受体激动剂Exendin-4的基础上，设计了一类Exendin-4类似物。该类 类似物首次将其进行多肽非活性位点的半胱氨酸替换，通过半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺 发生点击化学反应来方便高效地引入小分子基团，可避免早期长效化GLP-1受体激动剂的 研发过程中，采用赖氨酸作为小分子基团连接壁的选择性差，反应不方便等问题。此外，小 分子基团具有较强的血清白蛋白结合率，可增加缀合物与血清白蛋白的结合，延长肽链的 作用时间，可避免GLP-1的肾脏快速滤过和代谢失活，因而该类化合物的半衰期及体内降糖 作用时间显著延长。
【发明内容】
[0014] 本发明涉及一类艾塞那肽(Exendin-4)类似物，其序列为：
[0015] His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaal-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Xaa2-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser_Xaa3
[0016] 其中：
[0017] Xaal:化学修饰的Cys或Lys;
[0018] Xaa2:化学修饰的Cys或Trp;
[0019] Xaa3:化学修饰的 Cys 或-NH2;
[0020] 化学修饰的Cys结构为
[0022] 这里：η选自6~14。
[0023]其中，优选的脂肪链修饰Cys结构为
[0025]在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的Exendin-4类似物：
[0030]在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的Exendin-4类似物：
[0032] 本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种上述化合物和其药 学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂。
[0033] 本发明进一步提供了上述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体 或稀释剂在制备用于糖尿病的药物中的运用。
[0034]本发明提供的上述化合物化学性质稳定，部分化合物血浆半衰期达到了 30h以上， 较原型Exendin-4(半衰期2.4h)有显著的提高。另外，本发明提供的上述化合物或化合物作 为有效成分制备的药物组合物用于降低体内血糖浓度时，既有很长的血浆半衰期，高于目 前已经上市的化学修饰长效化多肽利拉鲁肽，又具有显著的降糖效果，而且可避免药剂学 手段长效化产品易产生的注射部位出现局部瘙痒等不良反应。
[0035]本发明还提供了上述化合物的制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护 固相合成策略高效快速地合成得到上述目标化合物。
[0036]以下是本发明中涉及的Exendin-4类似物的体外和体内降糖药理实验方法以及结 果：
[0037] (l)Exendin_4及Exendin-4类似物体外血衆稳定性实验
[0038]大鼠在取血浆前禁食12h(不禁水），乙醚麻醉，眼球采血于盛有肝素钠(30mg)的磨 口三角瓶中，采血过程中轻轻振摇三角瓶，使肝素钠均匀溶于血中。收集全血， 3000rpm.min-l离心15min，移取上清液，即得血衆。纯化后的Exendin-4和Exendin-4衍生物 用Tris缓冲液配成1000ng/ml的初始母液，100yL的化合物溶液与等体积大鼠血浆涡旋混 匀，pH = 7.4,37°C温孵。所有化合物都温孵24h以上，于0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48和 72h时间点取10yL温孵样品，加入20yL含有0.1 %TFA的乙腈沉淀，涡旋3min，14000rpm.min-1离心15分钟，上清液直接进LC-MS分析，记录不同时间点的质谱峰面积数值，做出降解曲 线，计算化合物的体外半衰期。如图1所示，没有经过改造的原型Exendin-4半衰期只有约 2.5h，而Exendin-4类似物的半衰期均得到延长，其中，最长的半衰期达到35.6个小时。
[0039] (2)Exendin-4及Exendin-4类似物的隔日降血糖实验
[0040] 正常昆明小鼠，分为8组，每组6只，小鼠饲养在标准化动物房中。实验开始时，提前 24h给予Exendin-4及Exendin-4类似物，对照组注射生理盐水。正常饮食饮水12h，接着禁食 12h，在化合物注射24h后，进行小鼠单次腹腔葡萄糖耐量实验。各组按照小鼠体重每千克腹 腔注射18mmol的葡萄糖溶液（浓度20%)，注射葡萄糖时定为Omin，在0，15,30,45,60， 120min用血糖仪测定血糖水平。
[0041 ] 表1 Exendin-4及Exendin-4类似物隔日降血糖的效应
[0044] n = 6，X±s_· *户<〇·〇5，**ρ<〇 · 〇1，***p<〇 · 〇〇lvs Exendin_4with saline as control
[0045] 如表1所示，由于修饰后的Exendin-4类似物的生物半衰期都达到了30h以上，所以 在体内代谢24h后，降血糖实验显示其促胰岛素分泌作用仍然维持，而未经改造的天然 Exendin-4早已失去活性，说明我们的Exendin-4类似物体内降糖作用时间显著的延长。
[0046] (3)Exendin-4及Exendin-4类似物的隔日多次口服葡萄糖耐量实验
[0047] 选取8周龄db/db糖尿病小鼠，随机分组，每组6只，适应性饲养7天后，在实验开始 前12小时禁食，只给予饮水。每组小鼠在给予Exendin-4及Exendin-4类似物之前，测初始血 糖值，定为-30min，然后腹腔给予Exend in-4类似物，30min后腹腔注射葡萄糖（每千克 18mmol )，定为Omin，对照组注射相同体积的生理盐水和Exendin-4aOmin，15min，30min， 60min，90min，120min分别尾部取血，测定血液葡萄糖浓度。并且于360min和720min再次注 射葡萄糖，继续测定血糖值，一共重复给予3次葡萄糖，检测化合物的长效化降糖活性。 [0048] 表2 Exendin-4及Exendin-4类似物多次腹腔葡萄糖耐量效应
[0051 ] η = 6，^Γ=*^.*ρ<〇·〇5，**Ρ<〇·01，***P<〇.〇〇lvs saline as control [0052] 如表2所示，Exendin-4在第三次腹腔糖耐量实验时已经失去活性，而所有的 Exendin-4类似物在三次给予葡萄糖过程中，仍然维持了较好的降糖活性，说明化合物经过 改造后，其长效化降糖作用显著。
[0053]本发明的优点在于：
[0054] 1.提出的一种长效化Exendin-4类似物可以在保留降糖活性的基础上，具有抗肾 脏滤过消除和抗DPP-IV酶解作用，生物半衰期较Exendin-4原型显著延长，部分达到了 30小 时以上，提高了稳定性，极大的延长了降糖作用时间。
[0055] 2.微波促进固相合成的Exendin-4类似物大大的提高了偶合反应速率，常规固相 合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微 波促进则平均只需要10分钟左右;常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小 时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合 成周期。此外，合成Exendin-4类似物的粗品纯度大于80%，较常规固相合成方法大大提高， 这方便了后续的纯化工作。微波促进固相合成Exendin-4类似物的方法易于实现自动化、大 规模化，这使其更适合工业化生产。
[0056]因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的Exendin-4类似物，收率高、合 成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的Exendin-4类似 物，结构全新，比天然Exendin-4更加稳定，降血糖作用时间长，适合作为治疗糖尿病药物的 活性成分。
【附图说明】
[0057]上文对本发明做了一般性描述，下面附图用于说明本发明的具体实施方案。其中： [0058] 图1显示的是原型Exendin-4和本发明的Exendin-4类似物的血衆温孵半衰期柱形 图；
【具体实施方式】
[0059] 在本说明书全文中采用以下缩写：
[0060] Et3N:三乙胺；NMM:N-甲基吗啉；DIEAJ，^-二异丙基乙胺；DMF:二甲基甲酰胺； DMS0:二甲亚砜;DCM:二氯甲烷;Fmoc:N-9-芴甲氧羰基;DIC:N，N'_二异丙基碳二亚胺;CDI: N，N'_羰基二咪唑;DMAP:4-二甲氨基吡啶;H0SU:N-羟基琥珀酰亚胺;EDC.HC1:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐;HATU:2-(7-偶氮苯并三氮唑)-Ν,Ν,Μ，^_四甲基脲六 氟磷酸酯;HBTU:苯并三氮唑-Ν,Ν,Υ-四甲基脲六氟磷酸酯;HCTU: 6-氯苯并三氮唑-1， 1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯;Η0ΑΤ: 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑;Η0ΒΤ: 1-羟基-苯并三氮唑； PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷;HPLC:高效液相色谱;ESI-MS:电喷雾 质谱;Gly:甘氨酸;Ser:丝氨酸;Ala:丙氨酸;Thr:苏氨酸;Val:缬氨酸；Ile:异亮氨酸;Leu: 亮氨酸;Tyr:酪氨酸;Phe:苯丙氨酸;Hi s:组氨酸;Pro:脯氨酸;Asp:天门冬氨酸;Met:蛋氨 酸;Glu:谷氨酸;Trp:色氨酸;Lys:赖氨酸;Arg:精氨酸。Asn:天冬酰胺;Gin:谷氨酰胺。
[0061] 本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解 释。
[0062] 实施例1
[0064]的微波促进固相合成 [0065] (1)侧链改构的半胱氨酸合成
[0066] 称取Fmoc-Cys-〇H 0.21g，溶于DCM中，加入0.12g N-正辛基马来酰亚胺，3ul DIEA 作为催化剂，室温下搅拌反应4小时，薄层板监测反应完毕后，反应液减压浓缩，柱层析分离 得产物0.278，收率79%。
[0067] MS(70eV)m/z：575.6([M+Na]+)〇
[0068] (2)树脂的溶胀
[0069] 称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0 · 4mmol/g)，经7mL DCM溶胀 30min，抽滤去DCM，再用lOmLNMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。
[0070] (3)微波促进Fmoc保护基的脱除
[0071] 将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M Η0ΒΤ的25%哌啶/匪?(￥八)溶液， 在微波反应器中反应lmin，微波功率为15W，反应温度控制在50°C以内，使用空气压缩机压 缩空气冷却，反应结束后滤去溶液;再加入7mL含0.1M HOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液在微 波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50°C，使用空气压缩机压缩空气 冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。
[0072] (4)微波促进Fmoc-Ser-Rink amide-MBHA Resin的合成
[0073] 将Fmoc-Ser-OH(0·04mmol)，HBTU(0·04mmol)，Η0ΒΤ(0·04mmol)和DIPEA (0.08mmol)溶于lOmLWP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微 波功率为25W，反应温度控制在50°C，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应 液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
[0074] (5)偶合效率的检测
[0075]用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下 一个偶合循环。
[0076] 茚三酮法:取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5 %茚三酮乙醇、KCN 吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中）、80 %苯酚乙醇溶液各2滴，于100°C加热5分 钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
[0077] 溴酚兰法:取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1 %的 溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
[0078] (6)肽链的延长
[0079]按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，合成 到肽链17位时，加入侧链改构的半胱氨酸，偶合45min，然后继续重复脱保护和偶合的步骤 依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有化合物的树脂。
[0080] (7)树脂上多肽的裂解
[0081 ]将上述得到的连有化合物的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯 甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V) 10mL，先在0 °C下振摇30min，再在常温下反应 3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析 出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到化合物的粗品63.2mg，收率为 94.3%〇
[0082] (7)多肽的纯化
[0083]将粗品多肽溶于50%的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为:C18反相 柱（320mm X 28mm，5μπι);流动相A: 0 · 1 % TFA/水(V/V)，流动相B: 0 · 1 %TFA/乙腈(V/V);流动 相梯度:流动相B 40 %~90 %，20min;流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得 纯品30mg。理论相对分子质量为4370 · 7DESI-MS m/z : found[M+3H]3+1457 · 9，[M+4H]4+ 1093· 7;calu[M+3H]3+1457· 7，[M+4H]4+1093 · 2。
[0084] 实施例2~9
[0085] 根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2~9的Exendin-4类似 物，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。
[0086] 实施例2
[0088] 理论相对分子质量为4426.8』51-1\^111/2:€〇1111(1[]\1+3!1]3+1476.6，[]\1+4!1] 4+ 1107.7;calu[M+3H]3+1476.8，[M+4H]4+1107.9。
[0089] 实施例3
[0091 ]理论相对分子质量为4483 · 6DESI-MS m/z : found[M+3H]3+1495 · 5，[M+4H]4+ 1121.9;calu[M+3H]3+1495.2，[M+4H]4+1121.9〇
[0092] 实施例4
[0094] 理论相对分子质量为4313.6』51-]\^111/2:€〇1111(1[]\1+3!1]3+1438.9，[]\1+4!1] 4+ 1079.4; calu[M+3H]3+1439.1，[M+4H]4+1079.7。
[0095] 实施例5
[0097] 理论相对分子质量为4369.7DESI-MS m/z:found[M+3H]3+1457.6, [M+4H]4+ 1093· 1;calu[M+3H]3+1457·9，[M+4H]4+1093 · 2。
[0098] 实施例6
[0100] 理论相对分子质量为4426 · 5ASI-MS m/z : found[M+3H]3+1476 · 5，[M+4H]4+ 1107·6;calu[M+3H]3+1476·6，[M+4H]4+1107 ·6〇
[0101] 实施例7
[0103] 理论相对分子质量为4498.8iSI-MS m/z:found[M+3H]3+1500.6, [M+4H]4+ 1125.7;calu[M+3H]3+1500.6，[M+4H]4+1025.4。
[0104] 实施例8
[0106] 理论相对分子质量为4554.9iSI-MS m/z:found[M+3H]3+1519.3, [M+4H]4+ 1139.7;calu[M+3H]3+1519.8，[M+4H]4+1139.5〇
[0107] 实施例9
[0109]理论相对分子质量为4611 · 7iSI-MSm/z: found[M+3H]3+1538 · 6，[M+4H]4+1153 · 9; calu[M+3H]3+1538.7，[M+4H]4+1153.3。
【主权项】
1. 一种艾塞纳肤巧xendin-4)类似物，其序列为： His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaal-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala- Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Xaa2-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇- Pr〇-Ser-Xaa3 其中： Xaal:化学修饰的切s或Lys; Xaa2:化学修饰的切S或Trp; Xaa3:化学修饰的切S或-N出； 化学修饰的切S结构为运里:η选自6~14。2. 根据权利要求1所述的艾塞纳肤巧xendin-4)类似物，优选的序列为：3. -种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种权利要求1中所述的艾塞纳肤 化xendin-4)类似物和其药学上可接受的盐。4. 一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种权利要求1中所述的艾塞纳肤 化xendin-4)类似物和药学上可接受的载体或稀释剂。5. 权利要求1中所述的艾塞纳肤化xendin-4)类似物和其药学上可接受的盐在制备用 于糖尿病的药物中的运用。6. 权利要求1中所述的艾塞纳肤化xendin-4)类似物和药学上可接受的载体或稀释剂 在制备用于糖尿病的药物中的运用。7. 权利要求1中所述的艾塞纳肤化xendin-4)类似物的制备方法，包括生物表达、液相 合成和固相合成制备方法。
【文档编号】C07K14/575GK105936647SQ201610283641
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】黄文龙, 钱海, 孙李丹, 蔡星光, 韩京, 褚莹莹, 周洁
【申请人】中国药科大学