迷你蛋白及其应用
【专利摘要】本发明公开了一类迷你蛋白及其应用。所述迷你蛋白以白蛋白结合域的3?α螺旋束为骨架蛋白，并且在所述骨架蛋白的三维结构表面、N端、C端中的至少一处引入有阳离子性氨基酸，并经所述阳离子性氨基酸至少连接p53与MDM2/MDMX结合的关键氨基酸位点。本发明的迷你蛋白兼具入胞以及与白蛋白、MDM2/MDMX结合的能力，并可良好抑制p53和MDM2/MDMX之间的相互作用，可用于制备抗癌药物等，可用于规模化生产和应用。
【专利说明】
迷你蛋白及其应用
技术领域
[00011 本发明涉及一类迷你蛋白，特别是一种可用于担当MDM2/MDMX和p53间相互作用抑 制剂的迷你蛋白，且此类迷你蛋白同时具有结合血清白蛋白的能力。
【背景技术】
[0002] p53是人类最重要的抑癌基因之一，由其表达产生的P53蛋白是抑癌功能执行者。 P53通过参与调控细胞周期阻滞、细胞分化和细胞凋亡，抑制不正常或潜在肿瘤细胞的增 殖。所有肿瘤的发生发展都伴随P53的失活或缺失，而通过恢复p53的活性则能达到抗肿瘤 效果。除了 P53基因缺失、突变引起的p53蛋白失活，还有一部分肿瘤并未发生p53基因的突 变，但由于受负性调节蛋白的影响，导致P53活性结构域被封闭或被泛素化降解，因此无法 阻止肿瘤细胞的发生发展。
[0003] MDM2(鼠双微粒体murine double minute2)是一类重要的负性调节蛋白。其既能 通过结合P53蛋白的反式激活结构域抑制其转录因子活性，又能通过其E3泛素连接酶的活 性介导P53蛋白降解。MDM2的同源蛋白MDMX同样起着下调p53水平的功能。正常细胞内P53与 MDM2/MDMX处于一种负反馈式的平衡状态，部分肿瘤过高表达MDM2/MDMX破坏了这一平衡而 导致p53失活。
[0004] 因此，抑制MDM2蛋白和p53相互作用是当前国外肿瘤治疗研究中的一个热点。基于 P53-MDM2复合物的结构信息，模拟结合态的ρ53 (α螺旋结构)得到同样能特异性结合MDM2的 分子，通过竞争性抑制Ρ53与MDM2结合，使得ρ53处于游离的活性状态，从而实现抗肿瘤的目 的。根据这一作用原理，此类功能分子被称为P53-MDM2抑制剂。此后解析出的p53-MDMX复合 物的结构显示它们的结合方式与P53-MDM2结合方式几乎相同。因此，针对MDM2设计的抑制 剂可能同样能够抑制P53-MDMX相互作用。
[0005] 目前针对P53-MDM2/MDMX研究较多的主要有小分子化合物及多肽类抑制剂。小分 子抑制剂由于其设计灵活多样，渗透性好，易到达病灶位置等优点。如：罗氏公司从2004年 报道了第一个用于抑制MDM2的小分子抑制剂以来，从未间断此类抑制剂的研发工作，其开 发出的Nutlins小分子抑制剂2010年即已进入I期临床实验阶段，其他制药公司的小分子抑 制剂也相继进入I期临床实验，但都处在验证阶段。小分子化合物体积较小，所含的功能基 团较少，很难满足同时与多个位点相互作用，另外其不稳定易被代谢及组织靶向性差等缺 点，因此应用前景不是很乐观。多肽类抑制剂由于其结构种类多变和较多的侧链基团，往往 结合或拮抗靶蛋白的能力更强、特异性更好。2013年，罗氏公司开发出了一种采用环化方式 来稳定结构的α螺旋短肽双抑制剂，以解决线性多肽生理环境下极易被酶降解而不稳定的 缺点。但是，事实上绝大多数P53-MDM2/MDMX多肽抑制剂的研究受到很大限制，主要有两大 原因：第一，p53、MDM2/MDMX位于细胞内，但多肽本身不具有入胞能力;第二，进入体内后，抑 制剂的体内循环时间太短，易被肾脏代谢排出体外，无法发挥药效。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的之一在于提供一类迷你蛋白或其突变体，其具有入胞能力和结 合血清白蛋白的能力，在体内循环滞留时间长，可用于抑制MDM2/MDMX和p53之间相互作用， 以便治疗癌症，从而克服现有技术中的不足。
[0007] 本发明的目的之二在于提供所述迷你蛋白的用途。
[0008] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
[0009] 本发明实施例提供了一类迷你蛋白，其以白蛋白结合域的3_〇螺旋束为骨架蛋白， 所述骨架蛋白的三维结构表面、N端、C端中的至少一处引入有阳离子性氨基酸，并且所述骨 架蛋白还经所述阳离子性氨基酸至少连接P53与MDM2/MDMX结合的关键氨基酸位点。
[0010] 进一步的，所述骨架蛋白包括天然存在的或人工合成的3-α螺旋迷你蛋白。
[0011] 进一步的，所述阳离子性氨基酸分布于所述迷你蛋白的Ν端和/或C端。
[0012] 进一步的，所述阳离子性氨基酸分布于3_〇螺旋束的外表面。
[0013] 进一步的，所述阳离子性氨基酸包括精氨酸或赖氨酸。
[0014] 进一步的，所述骨架蛋白的三维结构表面的净电荷与所述迷你蛋白自身分子量的 比值大于1。
[0015]进一步的，所述Ρ53与MDM2/MDMX结合的关键氨基酸位点为苯丙氨酸(F)、酪氨酸 (Υ)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)，且该四个关键氨基酸位点处于同一个α螺旋束上。
[0016]进一步的，所述苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸位点沿从Ν端到C端的方向依次 分布在同一个α螺旋束上的第η、(η+3)、(η+4)、(η+7)个位点，η为正整数。
[0017 ]本发明实施例提供了所述的迷你蛋白在制备用于抑制MDM2/MDMX和ρ 5 3之间相互 作用的抑制剂中的用途。
[0018] 本发明实施例提供了一种Ρ53与MDM2/MDMX相互作用的抑制剂，其包含所述迷你蛋 白。
[0019] 与现有技术相比，本发明的优点至少在于:提供的迷你蛋白兼具入胞以及与白蛋 白、MDM2/MDMX的结合能力，并可良好抑制ρ5 3和MDM2/MDMX之间的相互作用，并可用于制备 抗癌药物等，且可进行规模化生产和应用。
【附图说明】
[0020] 图1本发明一典型实施方案之中一类迷你蛋白的结构示意图；
[0021] 图2a-图2b分别是本发明实施例1中野生型、关键氨基酸嫁接的小蛋白与MDM2/ MDMX结合的荧光偏振检测图谱；
[0022]图3a_图3b分别是本发明实施例2中野生型、关键氨基酸嫁接的小蛋白与白蛋白的 亲和能力检测图谱；
[0023] 图4是本发明实施例3中野生型、关键氨基酸嫁接、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基 酸性氨基酸引入(两者都引入)的各种小白蛋白的螺旋结构测定结果；
[0024] 图5是本发明实施例4中野生型、关键氨基酸嫁接、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基 酸性氨基酸引入的各种小白蛋白的溶血检测结果；
[0025] 图6是本发明实施例5中野生型、关键氨基酸嫁接、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基 酸性氨基酸引入的各种小白蛋白的入胞能力比较结果；
[0026] 图7是本发明实施例6中野生型、关键氨基酸嫁接、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基 酸性氨基酸引入的各种小白蛋白的稳定性检测结果。
【具体实施方式】
[0027]鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明 的技术方案，其主要是通过核酸定点突变、分子克隆及多肽合成等技术，将P53与MDM2/MDMX 结合的关键氨基酸位点"嫁接"在白蛋白结合域的3_〇螺旋束骨架蛋白上，形成一类迷你蛋 白（其典型结构可参阅图1)，使其既保留与白蛋白的结合能力，又具有与MDMD2/MDMX的结合 能力，发挥P53和MDM2/MDMX的抑制剂作用。
[0028]前述的"抑制相互作用"或"抑制剂作用"意味着阻止或减少一种或多种分子、肽、 蛋白、酶或受体的直接或间接的结合，或者阻止或减少一种或多种分子、肽、蛋白、酶或受体 的正常活性。
[0029]前述的"p53和MDM2/MDMX的抑制剂"是用来描述所述迷你蛋白及其突变体能与 MDM2/MDMX结合，从而释放p53,使p53行使其抑癌功能，从而杀死癌细胞的能力。
[0030] 前述的"MDM2/MDMX"是指mdm2/mdmx基因表达而得到的蛋白。在此术语的意义内， MDM2/MDMX包括所有被mdm2/mdmx编码的蛋白，其突变体、另路剪接蛋白和磷酸化蛋白以及 包括其它动物的MDM2/MDMX同源物及类似物，例如人同源HDM2或人类似物HDMX。
[0031] 以下结合若干实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的解释说明。
[0032] 如下各实施例中述及的迷你小蛋白均由多肽合成公司合成提供。
[0033]表1实施例1-6中各小蛋白的序列
[0034]
[0035] 实施例1野生型及关键氨基酸嫁接的小蛋白与MDM2/MDMX的结合检测
[0036] 取含50nM FITC-p53与luM MDM2/MDMX的混合物，将野生型（1号）及关键氨基酸嫁 接的小蛋白（2号)及p53多肽分别从37.5uM倍比稀释12个浓度，并与前述混合物相互作用半 小时，再在酶标仪上检测其焚光偏振强度，计算前述小蛋白与MDM2/MDMX的抑制浓度，结果 可参阅图2。
[0037]实施例2野生型及关键氣基酸嫁接的小蛋白与白蛋白的未和能力检测 [0038]首先，将白蛋白HSA(20ug/ml)固定在CM5芯片上，将实施例1中所述的1号、2号小蛋 白配制成浓度为0、〇. 2ug/ml、0.4ug/ml、0.8ug/ml、1.6ug/ml、3.2ug/ml的溶液，这些溶液中 采用的缓冲液均为HBS-EP。
[0039] 实施例3野生型、关键氨基酸嫁接、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基酸性氨基酸引入 的各种小白蛋白的螺旋结构测定
[0040] 将前述的1号、2号蛋白、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基酸性氨基酸引入的3号、4 号、5号小蛋白用F>BS缓冲液配制成浓度为0.4mg/ml的溶液，置于圆二色光谱仪上，检测其α 螺旋情况，测试结果可参阅图4。
[0041]实施例4野生型、关键氨基酸嫁接、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基酸性氨基酸引入 的各种小白蛋白的溶血检测
[0042] 将前述的1号、2号、3号、4号、5号小蛋白用PBS分别配成浓度为150uM、75uM、 37 · 5uM、18 · 75uM、9 · 375uM、4 · 6875uM、0uM的、且含5%Triton100 的溶液，并与 107个红细胞 37 °C共孵育lh，检测450nm处的吸收值，结果可参阅图5。
[0043]实施例5野生型、关键氨基酸嫁接、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基酸性氨基酸引入 的各种小白蛋白的入胞能力比较
[0044]将前述的1号、2号、3号、4号、5号小蛋白用PBS分别配成浓度为50uM的溶液，并与铱 化合物Ir(ppy)(H2〇)2以1:1标记，使其标记上绿色焚光。将由此形成的标记蛋白用高糖DMEM 培养基稀释至浓度为2uM，并与Hela细胞在37°C共孵育24小时，再于共聚焦显微镜及流式细 胞仪上检测其入胞情况，结果可参阅图6。
[0045]实施例6野生型、关键氨基酸嫁接、关键氨基酸嫁接及阳离子氨基酸性氨基酸引入 的各种小白蛋白的稳定性检测
[0046] 将前述的1号、2号、3号、4号、5号小蛋白用roS分别配成浓度为30uM、15uM、7.5uM、 3.75uM的溶液，并与与纯血清37°C共孵育48h，再以SDS-PAGE电泳定量小蛋白的保留率，结 果可参阅图7。
[0047]应当理解，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细 节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。 因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范 围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范 围内的所有变化囊括在本发明内。
【主权项】
1. 一类迷你蛋白，其特征在于所述迷你蛋白以白蛋白结合域的3-〇螺旋束为骨架蛋白， 所述骨架蛋白的三维结构表面、N端、C端中的至少一处引入有阳离子性氨基酸，并且所述骨 架蛋白还经所述阳离子性氨基酸至少连接P53与MDM2/MDMX结合的关键氨基酸位点。2. 根据权利要求1所述的迷你蛋白，其特征在于:所述骨架蛋白包括天然存在的或人工 合成的3-α螺旋迷你蛋白。3. 根据权利要求1所述的迷你蛋白，其特征在于:所述阳离子性氨基酸分布于所述迷你 蛋白的Ν端和/或C端。4. 根据权利要求1、3或4所述的迷你蛋白，其特征在于:所述阳离子性氨基酸分布于3-α 螺旋束的外表面。5. 根据权利要求1-3中任一项所述的迷你蛋白，其特征在于:所述阳离子性氨基酸包括 精氨酸或赖氨酸。6. 根据权利要求1-3中任一项所述的迷你蛋白，其特征在于:所述骨架蛋白的三维结构 表面的净电荷与所述迷你蛋白自身分子量的比值大于1。7. 根据权利要求1所述的迷你蛋白，其特征在于:所述ρ53与MDM2/MDMX结合的关键氨基 酸位点分别为苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Υ)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)，该四个关键氨基酸位点处 于同一个α螺旋束上。8. 根据权利要求1所述的迷你蛋白，其特征在于:所述苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨 酸位点沿从Ν端到C端的方向依次分布在同一个α螺旋束上的第η、（η+3)、（η+4)、（η+7)个位 点，η为正整数。9. 如权利要求1-8中任一项所述迷你蛋白在制备用于抑制MDM2/MDMX和ρ53之间相互作 用的抑制剂中的用途。10. -种ρ53与MDM2/MDMX相互作用的抑制剂，其特征在于包含权利要求1-9中任一项所 述的迷你蛋白。
【文档编号】C07K14/47GK105936646SQ201610072523
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年2月2日
【发明人】费浩, 贾俊丽, 丁皓中
【申请人】中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所