一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化sod冻干粉的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，将三角帆蚌软体组织破碎后，经过匀浆、超滤、盐析、超滤、热变性、柱层析、脱盐与浓缩、冻干等工序，最后得到SOD冻干粉产品。本发明使用珍珠采收后的蚌肉组织做原料，在沉淀杂蛋白时采用无机盐，沉淀效果好，省时省力，适于规模化生产。
【专利说明】
_种从三角帆蛛的蛛肉中提取纯化SOD冻干粉的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物工程的技术领域，特别是涉及一种珍珠加工下脚料一一三角帆蚌蚌肉中提取、纯化超氧化物歧化酶SOD的方法。
【背景技术】
[0002]超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，S0D)是一种广泛存在于生物体内，能清除生物体内的超氧阴离子自由基(02—)，维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶，具有抗辐射损伤、抗衰老和抗癌等重要作用。目前，不同来源的SOD已被应用于治疗炎症、自身免疫性疾病、肺水肿、肿瘤等疾病的诊治，并广泛应用于医学、食品和化妆品等众多领域。
[0003]自1969年首次从牛红细胞中分离出SOD以来，人们相继从动植物和微生物中分离和纯化出了S0D。但由于疯牛病等疾病的影响，陆生动物血液等组织来源的SOD提取及其应用受到了很大的限制，从植物和微生物中提取SOD的方法多采用分步盐析、有机溶剂和层析等方法，这些方法普遍存在生产工艺复杂、成本高、周期长等缺点。从水产品中提取纯化SOD的报道相对较少，牡蛎等海产贝类由于个体小且本身经济价值较高，利用这些海产贝类难以大规模提取S0D。而利用珍珠采收后丰富的蚌肉废弃物资源进行SOD提取纯化与应用则更少见报道。
[0004]我国是淡水珍珠养殖大国，三角帆蛛(//jpr1sis是我国特有的淡水育珠蚌，由该蚌生产的珍珠占国际珍珠总产量的近90%。三角帆蚌多在1-2龄左右进行植珠，经3-4年养殖后采收珍珠，单个蚌体可达Ikg左右，杀蚌采珠后会产生大量的蚌肉:以年产约1000吨珍珠估算，蚌肉可达2-3万吨。但目前蚌肉资源除了进行简单加工做饲料等用途外，大部分被采珠同时直接搅碎排放，不仅极大地浪费了蚌肉资源，还严重污染了环境。蚌肉营养丰富，除含有丰富的蛋白质外，还含用超氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物质，对蚌肉进行SOD的提取和利用将极大提高珍珠养殖的附加值、减少环境污染，产生良好的经济和社会效益。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的上述技术问题，本发明的目的是提供了一种从三角帆蚌蚌肉中提取、纯化SOD冻干粉的方法，使用珍珠采收后的蚌肉组织做原料，在沉淀杂蛋白时采用无机盐，沉淀效果好，省时省力，适于规模化生产。
[0006]为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的:
一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，包括以下步骤:将三角帆蚌软体组织破碎后，经过匀浆、超滤、盐析、超滤、热变性、柱层析、脱盐、浓缩和冻干，最后得到SOD冻干粉产品。
[0007]所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，包括以下步骤:
(I)匀浆:收集珍珠采集后的三角帆蚌，挖取所有蚌肉称重，以蚌肉和匀浆缓冲液I: I的比例混匀，用高速匀浆机匀浆，搅拌0.5-lh，离心去碎组织细胞碎片，取上清液；
(2)超滤:将步骤(I)中的上清液用可截留分子量为45kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，取滤液；
(3)盐析:将超滤液用硫酸铵进行盐析分离，4°C静置2-3h，1000g离心15-20min，收集沉淀；
(4)二次超滤:将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5-8kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，浓缩SOD，并去除盐类和其他小分子物质，取滤液；
(5)热变性:将浓缩液在60-70°C条件下加热变性10-15min，冷却后，1000g离心15-20min，去除杂蛋白，收集上清；
(6)层析纯化:将上述热变性溶液上样到预先用平衡液平衡的DEAE52纤维素柱中，经过液平衡，再用洗脱液进行梯度洗脱，收集下柱液；
(7)脱盐与浓缩:将上述的蛋白洗脱液装于透析袋内，在0-4°C，流动条件下进行透析除盐12-24h;再用聚乙二醇浓缩透析液，形成透析浓缩液；
(8)冻干:将步骤(7)中的透析浓缩液进行低温冷冻，并放置于冻干机中，进行真空冷冻干燥，得到SOD冻干粉。
[0008]所述的蚌肉匀浆缓冲液采用含5mmol/L CuCl2的0.15mol/L NaCl溶液。
[0009]所述盐析的硫酸铵为90%饱和度，结合超滤，去除45 kDa以上和5-8 kDa的小分子蛋白质。
[0010]所述热变性所采用的条件为:60-70°C条件下加热变性10-15min。
[0011]所述离子交换层析所采用的平衡液为pH8.0的25mmol/LTriS-HCl，洗脱液为pH8.0，#0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl。
[0012]上述透析除盐所用的透析液为高纯水;所用聚乙二醇为PEG 4000-20000ο
[0013]本发明从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法具有以下几个特点:
1、本发明采用的原料上使用珍珠采收后的软体组织，不加抗凝剂，这样省时省力，适于规模化生产。
[0014]2、本发明在沉淀杂蛋白时不用有毒害作用的氯仿，也不用易挥发的乙醇，而用无机盐，不仅沉淀效果好，又减少了环境污染和对生产人员的身体伤害。
[0015]3、本发明利用SOD蛋白酶耐热的特点，通过膜超滤，去除45KDa以上的大分子蛋白，利用90%饱和度的中性盐硫酸铵沉淀SOD效果好、活性高;然后利用二次超滤，去除盐离子和小分子杂质等，得到SOD蛋白酶。
[0016]4、本发明综合生物与化学方法，采用高效分离、提取及纯化技术，生产方法简单、周期短、污染小，适用于大规模工业化生产。经检测，采用本方法提取的S0D，其单位酶活可以达到1200U/mg以上。
[0017]5、本发明从水产品一三角帆蚌中提取SOD蛋白酶，而且是从珍珠采收下脚料一蚌肉中提取生物酶制剂，有利于为丰富的蚌肉资源的开发利用提供新出路，提高珍珠养殖的附加值、减少环境污染，为食品和医学领域提供SOD酶制剂，产生良好的经济和社会效益。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0019]实施例1
收集采珠后的三角帆蛛蛛肉Ikg，沥干水分；
配制1000ml NaCl溶液，加入1.0325g CuCl2.2H20，溶解后作为抽提缓冲溶液;将蚌肉用高速勾楽机勾楽，操作条件为4°C条件下，3000rpm，勾楽1min; 1000g离心15min，取上清;
将上清液用可截留分子量为45 kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，得滤液300ml;
加入固体硫酸铵至60%饱和度，4 °C静置2h，10000g离心15min，取上清;上清中再加入固体硫酸铵至90%饱和度，4°C静置2h，离心20min，收集沉淀；
将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5-8kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，取滤液；将超滤液先在70°C条件下加热变性15min，再在65°C，15min，冰浴冷却后，1000g，离心15min，去除杂蛋白，收集上清；
预先用PH8.0的25mmol/LTriS-HCl平衡液平衡DEAE 52纤维素柱;将热变性溶液上样到柱中，经 12h平衡，再用ρΗ8.0，含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl溶液以2ml/min的速度进行梯度洗脱，收集下柱液；
将层析洗脱液装于截留分子量为5 KDa的透析袋内，在4°C，流动条件下进行透析除盐24h;再在透析外加入PEG 4000浓缩透析液；
将上述透析浓缩液预先在-40°C进行急冻，然后放置于冷冻干燥机，得到SOD酶冻干粉。经检测，SOD比活性为1520 U/mg，蛋白含量96.5%。
[0020]实施例2
收集采珠后的三角帆蛛蛛肉5kg，沥干水分；
先配制5000ml NaCl溶液，然后加入5.1625g CuCl2.2H20，配置抽提缓冲溶液;将蚌肉，用高速勾楽机勾楽在2°C条件下，3000rpm，勾楽10min;42°C，1000(^离心15111；[11，取上清；将上清液用可截留分子量为45kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，得滤液1450ml;
加入固体硫酸铵至45%饱和度，不断搅拌，4°C静置3h，1000g离心15min，取上清;上清中再加入固体硫酸铵至90%饱和度，40C静置3h; 4°C，12000g离心15min，收集沉淀；
将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5-8kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，收集滤液；
将超滤液先在65°(:，预热变性51^11，再在60°(:，151^11，磁力搅拌器加热搅拌;冰浴冷却后，10000g，离心15min，去除杂蛋白，收集上清；
将热变性溶液上样到预先用PH8.0的25mmol/LTris-HCl平衡液平衡DEAE52柱中，经24h平衡，再用PH8.0的含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl溶液以lml/min的速度进行梯度洗脱，收集洗脱液；
将洗脱液装于截留分子量为5 kDa的透析袋内，在4°C，磁力搅拌条件下进行透析除盐12h;再在透析外加入PEG 6000浓缩透析液；
将上述透析浓缩液预先在-30 °(:进行急冻，然后放置于冷冻干燥机，得到SOD酶冻干粉，经检测SOD比活性为1268 U/mg，蛋白含量95.8%。
[0021]上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，其特征在于包括以下步骤:将三角帆蚌软体组织破碎后，经过匀浆、超滤、盐析、超滤、热变性、柱层析、脱盐、浓缩和冻干，最后得到SOD冻干粉产品。2.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)匀浆:收集珍珠采集后的三角帆蚌，挖取所有蚌肉称重，以蚌肉和匀浆缓冲液1:1的比例混匀，用高速匀浆机匀浆，搅拌0.5-lh，离心去碎组织细胞碎片，取上清液； (2)超滤:将步骤(I)中的上清液用可截留分子量为45kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，取滤液； (3)盐析:将超滤液用硫酸铵进行盐析分离，4°C静置2-3h，1000(^离心15-201^11，收集沉淀； (4)二次超滤:将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5-8kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，浓缩SOD，取滤液； (5)热变性:将浓缩液在60-70°C条件下加热变性10-15min，冷却后，1000g离心15-20min，去除杂蛋白，收集上清； (6)层析纯化:将上述热变性溶液上样到预先用平衡液平衡的DEAE52纤维素柱中，经过液平衡，再用洗脱液进行梯度洗脱，收集下柱液； (7)脱盐与浓缩:将上述的蛋白洗脱液装于透析袋内，在0-4°C，流动条件下进行透析除盐12-24h;再用聚乙二醇浓缩透析液，形成透析浓缩液； (8)冻干:将步骤(7)中的透析浓缩液进行低温冷冻，并放置于冻干机中，进行真空冷冻干燥，得到SOD冻干粉。3.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，其特征在于:所述的蚌肉匀浆缓冲液采用含5mmol/L CuCl2的0.15mol/L NaCl溶液。4.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，其特征在于:所述盐析的硫酸铵为90%饱和度，结合超滤，去除45 kDa以上和5-8 kDa的小分子蛋白质。5.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，其特征在于所述热变性所采用的条件为:60-70°C条件下加热变性10-15min。6.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，其特征在于:所述离子交换层析所采用的平衡液为PH8.0的25mmol/LTriS-HCl，洗脱液为pH8.0，含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl。7.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法，其特征在于:所用聚乙二醇为PEG 4000-20000。
【文档编号】C12N9/02GK106011091SQ201610452905
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】杨受保
【申请人】绍兴文理学院