一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法，在制备孟鲁斯特中间体的过程中，采用本发明的工程化酮还原酶多肽，与现有技术相比，酶用量低、反应时间短、底物浓度高，更加适合产业化应用。
【专利说明】
-种工程化酬还原酶多化及其用于制备孟鲁斯特中间体的 方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物制药和生物转化技术领域，具体设及一种工程化酬还原酶多肤及 其制备孟鲁斯特中间体的方法。
【背景技术】
[0002] 孟鲁斯特(Montelukast，CAS号158966-92-8)是一种选择性白Ξ締受体括抗剂 (LTRA)，用于预防和治疗哮喘、支气管收缩和过敏性鼻炎，具有重要的市场价值。孟鲁斯特 的分子结构专利于2012年8月3日到期，因此能够有效地合成其有效成分2-(3-(3-(化)-2- (7-氯哇嘟基）乙締基)苯基)-(35)-3-?丙基）苯甲酸甲醋的方法具有广阔的应用前景。一 条常见的合成路线如下式所示：
[0003]
[0004] 化学法工艺中利用(-)-二异松羡基氯棚烧类催化剂（（-)-DIP-Cl)进行不对称加 氨催化(J.Am.Chem. Soc. 1996，118，2521 和W0 2008/009970)。（-)-DIP-Cl存在原子经济性 差，操作步骤繁琐，分离复杂，污染严重等问题。生物转化方法如Org. Process 1?63.06￥.2010，14，193和￥0 2009/04298441等报道，该方法存在酶量较高(3%)，反应时间 长(24h)，底物浓度低（12 % )和有机溶剂用量(60 % )较高等问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服了现有技术的不足，提供一种工程化酬还原酶多肤及其制备 孟鲁斯特中间体的方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明提供了一种能够将底物2-(3-(3-(化)-2-(7-氯哇嘟基） 乙締基）苯基)-3-酬丙基)苯甲酸甲醋转化为产物2-(3-(3-(化)-2-(7-氯哇嘟基）乙締基） 苯基)-(35)-3-?丙基)苯甲酸甲醋的工程化酬还原酶多肤，其特征在于，所述酬还原酶多 肤的氨基酸序列与SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、 38、40、42和44中的任一序列具有至少90 %的同源性。其中，序列2为来自Candida magnoliae的野生型酬还原酶，其他的序列通过易错PCR等随机突变和活性位点盒式突变 (CASTing)等定点突变方法获得，突变体获得增强的活性和稳定性，可W通过高通量筛选 化TS)等方法探知，上述的改变氨基酸序列和筛选突变体库方法，均为本领域内的常规技 术。
[0007] 本发明提供了一种编码多肤的多核巧酸。优选地，所述多核巧酸选自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列，其表 达的蛋白如上文所示。
[0008] 本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含与适于在宿主细胞中指导被编码 的多肤的表达的控制序列可操作地连接的多核巧酸。优选地，该多核巧酸的序列为SEQ ID N0：43〇
[0009] 本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体。优选地，该宿主 细胞为大肠杆菌。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种制备孟鲁斯特中间体的方法，所述方法W化合物 1为底物，在适于将其还原为化合物2的反应条件下与所述的酬还原酶多肤接触，其中：
[0011] 所述化合物1的结构式为：
,〇
[0015] 优选地，所述还原反应是在辅酶和辅酶再生系统的存在下进行的，其中，所述的辅 酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氨酶。
[0016] 进一步优选地，所述的葡萄糖脱氨酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌 号为EW002的葡萄糖脱氨酶。
[0017] 进一步优选地，所述的还原反应在助溶剂条件下进行，所述的助溶剂为甲苯。
[0018] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：在制备孟鲁斯 特中间体的过程中，采用了本发明的工程化酬还原酶，克服了现有技术中反应性能欠佳的 问题，其酶用量低(2 % )，反应时间短（1化），底物浓度高，可达20 %，更加适合产业化应用。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于W下实施 例。实施例中采用的实施条件可W根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施 条件为常规实验中的条件。
[0020] 实施例1(酬还原酶的制备）：
[0021] 采用常规方法制备获得了酬还原酶催化剂:序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43基因片段由苏州金唯智生物科技有限公司合 成，与祀T30a(Novagen)质粒的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL2UDE3)菌株，筛选得 到阳性克隆子，接种到含有抗性的液体LB培养基中，于37°C培养至0D600至0.8，加入诱导剂 IPTG，继续培养16小时，离屯、收集沉淀，加入憐酸盐缓冲液悬浮，冰水浴中超声波破碎10分 钟，离屯、取上清，冷冻得到酬还原酶酶粉。
[0022] 实施例2(酬还原酶的筛选）
[0023] 由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43分 别在大肠杆菌中表达获得的酬还原酶2mg，葡萄糖脱氨酶(采购自苏州汉酶生物技术有限公 司，牌号EW002)2mg，NADP Img，底物2-(3-(3-(化)-2-(7-氯哇嘟基）乙締基）苯基)-3-酬丙 基)苯甲酸甲醋50mg、葡萄糖50mg加至装有2mL 0.05ΜΞ乙醇胺缓冲液的5mL反应器中，30°C 10(Κ)巧m揽拌，比后取样HPLC检测，序列43的转化率和ee均为>99%，因此采用序列43作为进 一步研究对象。
[0024] 实施例3(酶催化反应）：
[0025] 向50mL反应Ξ口瓶中依次加入lOOmg酬还原酶（由序列43在大肠杆菌中表达获 得），20mg葡萄糖脱氨酶(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002)和5mg NADP的Ξ 乙醇胺缓冲液，5g底物2-(3-(3-(化)-2-(7-氯哇嘟基）乙締基)苯基)-3-酬丙基)苯甲酸甲 醋，3.5g葡萄糖，20血0.05M pH 7.0Ξ乙醇胺缓冲液，5血甲苯，溫度调节至30°C，9(K)r/min 揽拌，15%化2〇)3溶液维持抑至7.0，反应12h，HPLC检测转化率99%，加入甲醇30ml，60°C回 流化，过滤后向滤液中滴加去离子水至不再有固体析出，过滤取滤饼60°C下加入甲醇至恰 好溶解后，滴加去离子水至不再有固体析出，过滤得到产品4.2g，纯度99 %，含量99 %。
[0026] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 ±能够了解本发明的内容并加 W实施，并不能W此限制本发明的保护范围，凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种能够将底物2-(3-(3-( (E)-2-(7-氯喹啉基）乙烯基)苯基)-3-酮丙基)苯甲酸甲 酯转化为产物2-(3-(3-( (E)-2-(7-氯喹啉基）乙烯基)苯基)-(3S)-3-羟丙基）苯甲酸甲酯 的工程化酮还原酶多肽，其特征在于，所述酮还原酶多肽的氨基酸序列与SEQ ID N0:2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42 和 44中的任一序列具有至 少90 %的同源性。2. -种编码根据权利要求1所述的多肽的多核苷酸。3. 根据权利要求2所述的多核苷酸，其选自SEQ ID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 中的任一序列。4. 一种表达载体，所述表达载体包含与适于在宿主细胞中指导被编码的多肽的表达的 控制序列可操作地连接的权利要求3所述的多核苷酸。5. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体。6. 根据权利要求5所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。7. -种制备孟鲁斯特中间体的方法，其特征在于，所述方法以化合物1为底物，在适于 将其还原为化合物2的反应条件下与权利要求1所述的酮还原酶多肽接触，其中： 所述化合物1的结构式为： 所述化合物2的结构：8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述还原反应是在辅酶和辅酶再生系统的 存在下进行的，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物 技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的还原反应在助溶剂条件下进行，所 述的助溶剂为甲苯。
【文档编号】C12N15/53GK106011092SQ201610440251
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】原海亮
【申请人】苏州汉酶生物技术有限公司