一种从香茶菜属植物同时制备细花线纹香茶菜苷a和咖啡酸乙酯的方法
【专利摘要】本发明提供一种从香茶菜属植物同时制备细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的方法，所述香茶菜属植物是指除了植物溪黄草Isodon serra(Maxim.)Kudo外的该属其它植物，所述方法包括如下步骤：I.药材的提取：药材用40％～95％的乙醇溶液提取；II.分离：药材提取液先后经过大孔树脂柱吸附洗脱、有机溶剂萃取等步骤得到混合物粗品；III.精制：混合物粗品经Sephadex LH?20柱层析、结晶和重结晶，得到高纯度的细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯。利用本发明的方法，可以为药材溪黄草的质量控制提供特征的对照品，从而为相关药品的质量控制提供保证。
【专利说明】
一种从香茶菜属植物同时制备细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸 乙酯的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生药学和天然产物化学领域，具体涉及一种从香茶菜属植物同时制备 细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的方法。
【背景技术】
[0002] 药材溪黄草，为民间习用草药，其味微苦，性凉，具清热、袪湿、利胆退黄的功效，用 于治疗湿热泻痢、跌打瘀肿、急性黄疸型肝炎和急性胆囊炎等疾病。以溪黄草为主要原料生 产的消炎利胆片已成为肝胆专科用药中销量第一的中成药。
[0003] 但是药材溪黄草的植物来源比较混乱。邓乔华等报道，广州清平市场上的溪黄草 不下十几种植物来源(邓乔华，王德勤等.溪黄草考证及性状鉴别法的验证[J].现代中药研 究与实践.2014,28(2):15-19)。2010年版《中国药典》附录111首次收载溪黄草的基原为唇形 科香茶菜属植物线纹香茶菜Isodon lophanthoides或溪黄草Isodon sorra(Maxim. )Kudo (sorra疑为serra之误）。实际上，唇形科香茶菜属的多种植物，如线纹香茶菜Isodon lophanthoides、细花线纹香茶菜（纤花香茶菜）Isodon lophanthoides var.graciliflora 和狭基线纹香茶菜Isodon lophanthoides var.gerardianus(Benth. )H.Hara等都作药材 溪黄草使用。
[0004] 虽然植物溪黄草Isodon serra(Maxim. )Kudo与药材溪黄草同名，药典也将其列为 药材的基原之一;但是在药材性味等方面，植物溪黄草Isodon serra与同属作溪黄草用的 其它植物都存在很大差异。具体而言，
[0005] ( - )黄汁特征
[0006] 线纹香茶菜和纤花香茶的新鲜及用水浸泡至湿润的干燥叶片，用手揉搓后有棕黄 色液汁，染黄手指;植物溪黄草的新鲜及用水浸泡至湿润的干燥叶片，用手揉搓后没有棕黄 色液汁，不染黄手指。
[0007] (二)性味特征
[0008] 线纹香茶菜和纤花香茶菜，味甘苦，性凉，民间一般称为"甜溪黄"。植物溪黄草味 极苦，性寒，民间称为"苦溪黄"。
[0009] 除上述区别外，邓乔华等还发现植物溪黄草的性状鉴别特征与线纹香茶菜及纤花 香茶菜均显著不同，与传统溪黄草经验鉴别特征也不相符；因此认为植物溪黄草是否能够 作为药材溪黄草使用值得商榷(邓乔华，王德勤等.溪黄草考证及性状鉴别法的验证[J].现 代中药研究与实践.2014,28(2): 15-19)。
[0010]此外，植物溪黄草(苦溪黄)与其它做溪黄草用的同属植物(甜溪黄)在化学成分上 也有显著差异。发明人经过研究发现，植物溪黄草不含细花线纹香茶菜苷A(结构式如1所 示)和咖啡酸乙酯(结构式如2所示），该两种成分却存在于其它"甜溪黄"植物中。因此，该两 种成分可以作为特征性成分用于药材溪黄草及含有药材溪黄草的中成药的定性鉴别、定量 检测和质量控制。
[0012] 但是高纯度的细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯对照品在市场上的来源有限，给 药材溪黄草及含药材溪黄草的中成药的质量控制工作带来不便。
【发明内容】
[0013] 针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种从香茶菜属植物同时制备细花线 纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的方法，所述香茶菜属植物是指除了植物溪黄草Isodon serra (Maxim. )Kudo外的该属其它植物，包括线纹香茶菜Isodon lophanthoides、细花线纹香茶 菜（纤花香茶菜）Isodon lophanthoides var.graciliflora和狭基线纹香茶菜Isodon Iophanthoides var. gerardianus(Benth. )H.Hara等。利用本发明所述方法，能够同时得到 高纯度的细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯，为药材溪黄草的质量控制提供特征的对照品。
[0014] 为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0015] -种从香茶菜属植物同时制备细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的方法，所述香 茶菜属植物是指除了植物溪黄草Isodon serra(Maxim. )Kudo外的该属其它植物，所述方法 包括如下步骤：
[0016] I.药材的提取
[0017]取所述香茶菜属植物干燥地上部分，用体积百分比浓度40 %~95 %的乙醇溶液I 提取药材，乙醇提取液减压浓缩至无醇味，得到药材提取液；
[0018] II.分离
[0019] 将步骤I得到的所述药材提取液，直接上大孔树脂I或者加水稀释后上大孔树脂I， 依次用水和体积百分比浓度50%~70%的乙醇溶液II洗脱，收集所述乙醇溶液II的洗脱 液，回收尽乙醇，浓缩至25 °C密度为1.5~3.5mg/mL的浓缩液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃 取，收集乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，干燥，得到乙酸乙酯部分;所述乙酸乙酯部分用体 积百分比浓度20%乙醇溶液III溶解至浓度为2.5~5.0mg/mL，上大孔树脂II，依次用体积 百分比浓度10%的乙醇溶液IV、体积百分比浓度20%的乙醇溶液III和体积百分比浓度 30%的乙醇V洗脱，收集所述乙醇溶液V洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得到混合物粗品；
[0020] III.精制
[0021] 将步骤II得到的混合物粗品用体积百分比浓度50 %~70 %甲醇溶液溶解，上 Sephadex LH-20柱，用体积百分比浓度50 %甲醇洗脱，等体积收集流份，分别合并含量较高 的细花香茶菜苷A和咖啡酸乙酯流份，减压浓缩，1~10°C温度下静置结晶，分离结晶和母 液，重结晶，晶体干燥，得到细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯。
[0022]优选的，所述香茶菜属植物选自线纹香茶菜Isodon lophanthoides、细花线纹香 茶菜（纤花线纹香茶菜）Isodon lophanthoides var.graciliflora和狭基线纹香茶菜 Isodon Iophanthoides var .gerardianus(Benth. )H.Hara中的一种或几种；更优选为细花 线纹香茶菜Isodon Iophanthoides var.graciliflora。
[0023]优选的，所述步骤I中，所述香茶菜属植物干燥地上部分用所述乙醇溶液I提取2~ 3次，每次所述乙醇溶液I的体积为所述香茶菜属植物干燥地上部分重量的10~14倍;更优 选为12倍。
[0024] 还优选的，所述步骤I中，所述乙醇溶液I的体积百分比浓度为40%~70%，更优选 为 50%。
[0025] 优选的，所述步骤I中，提取方法选自超声提取、加热回流提取和渗漉提取中的一 种或几种;更优选为超声提取，每次30~60分钟，更优选为40~50分钟。
[0026] 作为一个优选的实施方案，本发明所述的步骤I的具体操作为：
[0027] 取线纹香茶菜Isodon Iophanthoides、细花线纹香茶菜（纤花香茶菜）Isodon Iophanthoides var · graci 1 if 1 ora和狭基线纹香茶菜I sodon Iophanthoides var. gerardianus(Benth. )H.Hara中的一种或几种的干燥地上部分，用体积百分比浓度 40 %~70 %的乙醇溶液I超声提取3次，每次40~50分钟，每次所述乙醇溶液I的体积为药材 重量1 〇~14倍，过滤，合并滤液，减压浓缩至25 °C密度1.5~5.0mg/mL，得到药材提取液。
[0028] 作为一个更优选的实施方案，本发明所述的步骤I的具体操作为：
[0029] 取线纹香茶菜Isodon Iophanthoides、细花线纹香茶菜（纤花香茶菜）Isodon Iophanthoides var · graci 1 if 1 ora和狭基线纹香茶菜I sodon Iophanthoides var. gerardianus(Benth. )H.Hara中的一种或几种的干燥地上部分，用体积百分比浓度 50%的乙醇溶液I超声提取3次，每次40~50分钟，每次所述乙醇溶液I的体积为药材重量10 ~12倍，过滤，合并滤液，减压浓缩至25 °C密度2.5mg/mL，得到药材提取液。
[0030] 作为一个更进一步优选的实施方案，本发明所述的步骤I的具体操作为：
[0031 ] 取线纹香茶菜Isodon Iophanthoides、细花线纹香茶菜（纤花香茶菜）Isodon Iophanthoides var · graci 1 if 1 ora和狭基线纹香茶菜I sodon Iophanthoides var. gerardianus(Benth. )H.Hara中的一种或几种的干燥地上部分，用体积百分比浓度 50 %的乙醇溶液I超声提取3次，每次40分钟，每次所述乙醇溶液I的体积为药材重量12倍， 过滤，合并滤液，减压浓缩至25 °C密度2.5mg/mL，得到药材提取液。
[0032] 优选的，所述步骤II中，所述大孔树脂I选自D101或AB-8;更优选为AB-8。
[0033]优选的，所述步骤II中，所述大孔树脂I与药材的重量比为1:1。
[0034]优选的，所述步骤II中，水的用量为大孔树脂I柱体积的8~12倍，更优选为10倍。 [0035] 优选的，所述步骤II中，所述乙醇溶液II的体积百分比浓度为50%。
[0036]优选的，所述步骤II中，所述乙醇溶液II的用量为大孔树脂I柱体积的6~10倍，更 优选为8倍。
[0037]还优选的，所述步骤II中，所述浓缩液依次用石油醚和乙酸乙酯各萃取4~8次;更 优选6次。
[0038] 优选的，所述步骤II中，每次萃取，所述浓缩液和石油醚的体积比为1:1~2;更优 选为1: 1。
[0039] 优选的，所述步骤II中，每次萃取，所述浓缩液和乙酸乙酯的体积比为1:1~2;更 优选为1:1。
[0040]还优选的，所述步骤II中，所述大孔树脂II选自D101或AB-8。
[0041 ]优选的，所述步骤II中，所述大孔树脂II与药材的重量比为1:1。
[0042]优选的，所述步骤II中，所述乙醇溶液IV的用量为大孔树脂II柱体积的6~10倍； 更优选为8倍。
[0043]优选的，所述步骤II中，洗脱所述大孔树脂II时，所述乙醇溶液III的用量为大孔 树脂II柱体积的8~12倍;更优选为10倍。
[0044] 优选的，所述乙醇溶液V的用量为大孔树脂II柱体积的6~8倍;更优选为6倍。
[0045] 作为一个优选的实施方案，本发明所述步骤II的具体操作为：
[0046]将步骤I得到的所述药材提取液上D101或AB-8大孔树脂，先用8~12倍柱体积的水 洗脱，再用6~10倍柱体积的体积百分比浓度50%的乙醇溶液II洗脱，收集所述乙醇溶液II 的洗脱液，回收尽乙醇，浓缩至25 °C密度为1.5~3.5mg/mL的浓缩液;所述浓缩液先用体积1 ~2倍的石油醚萃取4~8次，弃去石油醚萃取液，再用体积1~2倍的乙酸乙酯萃取4~8次， 合并各次乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，干燥，得到乙酸乙酯部分;所述乙酸乙酯部分用 体积百分比浓度20%乙醇溶液III溶解至浓度为2.5~5.Omg/mL，上D101或AB-8大孔树脂， 先用6~10倍柱体积的体积百分比浓度10 %的乙醇溶液IV洗脱，再用8~12倍柱体积的体积 百分比浓度20 %的乙醇溶液IV洗脱，最后用6~8倍柱体积的体积百分比浓度30 %的乙醇洗 脱V，收集所述乙醇溶液V的洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得到混合物粗品。
[0047]作为一个更优选的实施方案，本发明所述步骤II的具体操作为：
[0048]将步骤I得到的所述药材提取液上AB-8大孔树脂，先用10倍柱体积的水洗脱，再用 8倍柱体积的体积百分比浓度50 %的乙醇溶液II洗脱，收集所述乙醇溶液II的洗脱液，回收 尽乙醇，浓缩至25 °C密度为1.5~3.5mg/mL的浓缩液;所述浓缩液先用等体积的石油醚萃取 6次，弃去石油醚萃取液，再用等体积的乙酸乙酯萃取6次，合并各次乙酸乙酯萃取液，回收 乙酸乙酯，干燥，得到乙酸乙酯部分;所述乙酸乙酯部分上D101或AB-8大孔树脂，先用8倍柱 体积的体积百分比浓度10 %的乙醇溶液IV洗脱，再用10倍柱体积的体积百分比浓度20 %的 乙醇溶液Π Γ冼脱，最后用6倍柱体积的体积百分比浓度30 %的乙醇洗脱V，收集所述乙醇溶 液V的洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得到混合物粗品。
[0049] 优选的，所述步骤III中，步骤II得到的所述混合物粗品用体积百分比浓度50%甲 醇溶液溶解，配制成浓度为3. Omg/mL的溶液。
[0050] 优选的，所述步骤III中，每流份为50mL。
[0051] 优选的，所述步骤III中，各流份用薄层层析法或高效液相色谱法检测成分;更优 选用高效液相色谱法检测成分。
[0052]本发明提供的从香茶菜属植物同时制备细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的方 法，包括上述的步骤I、步骤II和步骤III，优选的实施方案包括上述各步骤的优选的实施方 式的组合。
[0053]用本发明所述的方法，可以从多种香茶菜属植物中同时制备得到高纯度的细花线 纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯，经HPLC检测，纯度都可以达到98 %，产率分别为3.2 %和 4.0%。，从而为药材溪黄草及含药材溪黄草的中成药的定性定量质量检测提供了必要的对 照品。
[0054]本发明说明书中，如没有特殊说明，所述乙醇溶液是指乙醇的水溶液，所述甲醇溶 液是指甲醇的水溶液;所述水为去离子水、蒸馏水等经过净化纯化处理的水;所述柱体积是 指经过处理、充分浸泡的大孔树脂或Sephadex LH-20填充于层析柱后，大孔树脂或 Sephadex LH-20所占的体积，单位可以为毫升(mL)、升(L)或立方米(m3)。
【具体实施方式】
[0055] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0056] 如无特殊说明，下述实施例中所用的药材原料、试剂材料、仪器等，如无特殊说明， 均为市售购买产品。其中：
[0057] 1)仪器
[0058] 安捷伦1260型高效液相色谱仪，包括Chemstation色谱工作站、G1314B型DAD检测 器、G1311C型四元栗、G1329B型自动进样器、G1316A型柱温箱(美国Agilent公司）；
[0059] BT12?型十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司）；
[0060] 超声清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司，型号：KQ-300VDE，功率：300KW，频率： 45KHz)；
[00611 层析柱：10 X 120cm玻璃层析柱;5 X 80cm玻璃层析柱。
[0062] 2)药材
[0063]采于广州白云山和记黄埔中药有限公司清远溪黄草GAP种植基地，经华南植物园 叶华谷研究员鉴定分别为线纹香茶菜Isodon lophanthoides、细花线纹香茶菜(纤花香茶 菜）Isodon lophanthoides var. graciliflora和狭基线纹香茶菜Isodon Iophanthoides var · gerardianus(Benth· )H.Hara的干燥地上部分。
[0064] 3)试剂
[0065] 甲醇(分析纯）：规格:500mL，无锡市亚泰联合化工有限公司；
[0066] 95%乙醇(分析纯）：规格:500mL，广州嘉乐化工有限公司；
[0067]去离子水：自制；
[0068] AB-8大孔树脂，大城县鑫光化工有限公司；
[0069] Sephadex LH_20(上海宝曼生物科技有限公司）。
[0070] 4)对照品
[0071]细花线纹香茶菜苷A、咖啡酸乙酯：自制，HPLC检测纯度>98%。
[0072] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0073] 实施例1从细花线纹香茶菜干燥地上部分同时制备细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸 乙酯
[0074] I.药材的提取
[0075] 取干燥的细花线纹香茶菜药材（植物地上部分）2.0Kg，加入体积百分比浓度为 50%的乙醇溶液I，置于超声提取器中，超声提取3次，每次用24L(12倍体积重量)所述乙醇 溶液I，每次提取40分钟，过滤，合并各次滤液减压浓缩至密度2.5mg/mL，即得细花线纹香茶 菜提取液。
[0076] II.分离
[0077] 取经过预处理、充分浸泡的AB-8大孔树脂2. OKg，装柱。湿法上样，步骤I得到的所 述细花线纹香茶菜提取液，先用10倍柱体积去离子水洗脱，再用8倍柱体积浓度50% (体积 百分比浓度）的乙醇溶液II洗脱，收集乙醇溶液II的洗脱液，回收尽乙醇，浓缩至25 °C密度 为3.Omg/mL的浓缩液。所述浓缩液转移至萃取设备中，先用等体积石油醚萃取6次，弃去石 油醚萃取液，剩余的水层用等体积的乙酯乙酯萃取6次，弃去水层，收集乙酸乙酯萃取液，回 收乙酸乙酯，干燥，得到乙酸乙酯部分，用20% (体积百分比浓度）乙醇溶液III溶解配成浓 度为2.5mg/mL的溶液，再上AB-8大孔树脂柱，先用10倍柱体积浓度10% (体积百分比浓度） 的乙醇溶液IV洗脱，再用8倍柱体积浓度20% (体积百分比浓度）的乙醇溶液III洗脱，最后 用6倍柱体积浓度30% (体积百分比浓度）的乙醇溶液V洗脱，收集所述乙醇溶液V的洗脱液， 减压回收乙醇，得到混合物粗品150g。
[0078] III.精制
[0079]步骤II得到的所述混合物粗品用体积百分浓度50%的甲醇溶液溶解，配成浓度为 3. Omg/mL的溶液，上Sephadex LH-20柱，用体积百分比浓度50%的甲醇溶液等度洗脱，每流 份50mL，经HPLC检测，将含细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯纯度较高的流份分别合并，减 压浓缩，放冷，1~4 °C静置结晶，吸出母液，用体积百分浓度50 %的甲醇溶液洗涤结晶，50 % (体积百分比浓度）甲醇重结晶，真空干燥，得到细花香茶菜苷A 640mg，经HPLC检测，纯度为 98.1 %，咖啡酸乙酯800mg，经HPLC检测，纯度为98.3%。
[0080] 实施例2从线纹香茶菜干燥地上部分同时制备细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯
[0081] I.药材的提取
[0082]取干燥的线纹香茶菜药材(植物地上部分）2.0Kg，加入体积百分比浓度为70%的 乙醇溶液I，置于超声提取器中，超声提取3次，每次用20L(10倍体积重量)所述乙醇溶液I， 每次提取50分钟，过滤，合并各次滤液减压浓缩至密度3. Omg/mL，即得线纹香茶菜提取液。 [0083] II.分离
[0084] 取经过预处理、充分浸泡的D101大孔树脂2. OKg，装柱。湿法上样，步骤I得到的所 述线纹香茶菜提取液，先用12倍柱体积去离子水洗脱，再用10倍柱体积浓度60% (体积百分 比浓度）的乙醇溶液II洗脱，收集乙醇溶液II的洗脱液，回收尽乙醇，浓缩至60°C密度为 3.5mg/mL的浓缩液。所述浓缩液转移至萃取设备中，先用等体积石油醚萃取6次，弃去石油 醚萃取液，剩余的水层用等体积的乙酯乙酯萃取6次，弃去水层，收集乙酸乙酯萃取液，回收 乙酸乙酯，干燥，得到乙酸乙酯部分，用20% (体积百分比浓度）乙醇溶液III溶解配成浓度 为3.5mg/mL的溶液，再上AB-8大孔树脂柱，先用6倍柱体积浓度10% (体积百分比浓度)的乙 醇溶液IV洗脱，再用10倍柱体积浓度20% (体积百分比浓度）的乙醇溶液III洗脱，最后用8 倍柱体积浓度30 % (体积百分比浓度）的乙醇溶液V洗脱，收集所述乙醇溶液V的洗脱液，减 压回收乙醇，得到混合物粗品141g。
[0085] III.精制
[0086] 步骤II得到的所述混合物粗品用体积百分浓度60%的甲醇溶液溶解，配成浓度为 3. Omg/mL的溶液，上Sephadex LH-20柱，用体积百分比浓度50%的甲醇溶液等度洗脱，每流 份50mL，经HPLC检测，将含细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯纯度较高的流份分别合并，减 压浓缩，放冷，1~4 °C静置结晶，吸出母液，用体积百分浓度50 %的甲醇溶液洗涤结晶，50 % (体积百分比浓度）甲醇重结晶，真空干燥，得到细花香茶菜苷A 623mg，经HPLC检测，纯度为 98.6 %，咖啡酸乙酯773mg，经HPLC检测，纯度为98.4 %。
[0087]实施例3从狭基线纹香茶菜干燥地上部分同时制备细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸 乙酯
[0088] I.药材的提取
[0089] 取干燥的狭基线纹香茶菜药材（植物地上部分）2.0Kg，加入体积百分比浓度为 95 %的乙醇溶液I，加热回流提取，提取3次，每次用28L(14倍体积重量)所述乙醇溶液I，每 次提取60分钟，过滤，合并各次滤液减压浓缩至密度5 . Omg/mL，即得狭基线纹香茶菜提取 液。
[0090] II.分离
[0091] 取经过预处理、充分浸泡的AB-8大孔树脂2.5Kg，装柱。步骤I得到的所述狭基线纹 香茶菜提取液加入提取液重量50 %的水，搅拌均匀，过滤，取滤液湿法上样。先用8倍柱体积 去离子水洗脱，再用6倍柱体积浓度50% (体积百分比浓度）的乙醇溶液II洗脱，收集乙醇溶 液II的洗脱液，回收尽乙醇，浓缩至25°C密度为1.5mg/mL的浓缩液。所述浓缩液转移至萃取 设备中，先用2倍于所述浓缩液体积的石油醚萃取4次，弃去石油醚萃取液，剩余的水层用2 倍于所述浓缩液体积的乙酯乙酯萃取4次，弃去水层，收集乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯， 干燥，得到乙酸乙酯部分，用20% (体积百分比浓度）乙醇溶液III溶解配成浓度为4.5mg/mL 的溶液，再上D101大孔树脂柱，先用8倍柱体积浓度10 % (体积百分比浓度)的乙醇溶液IV洗 脱，再用12倍柱体积浓度20% (体积百分比浓度）的乙醇溶液III洗脱，最后用7倍柱体积浓 度30% (体积百分比浓度）的乙醇溶液V洗脱，收集所述乙醇溶液V的洗脱液，减压回收乙醇， 得到混合物粗品168g。
[0092] III.精制
[0093] 步骤II得到的所述混合物粗品用体积百分浓度50%的甲醇溶液溶解，配成浓度为 2.5mg/mL的溶液，上Sephadex LH-20柱，用体积百分比浓度50%的甲醇溶液等度洗脱，每流 份50mL，经HPLC检测，将含狭基线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯纯度较高的流份分别合并，减 压浓缩，放冷，1~4 °C静置结晶，吸出母液，用体积百分浓度50 %的甲醇溶液洗涤结晶，50 % (体积百分比浓度）甲醇重结晶，真空干燥，得到细花香茶菜苷A 615mg，经HPLC检测，纯度为 98.1 %，咖啡酸乙酯785mg，经HPLC检测，纯熟为98.7%。
[0094] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【主权项】
1. 一种从香茶菜属植物同时制备细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的方法，所述香茶 菜属植物是指除了植物溪黄草Isodon serra(Maxim. )Kudo外的该属其它植物，所述方法包 括如下步骤：1. 药材的提取 取所述香茶菜属植物干燥地上部分，用体积百分比浓度40 %~95 %的乙醇溶液I提取 药材，乙醇提取液减压浓缩至无醇味，得到药材提取液； Π .分呙 将步骤I得到的所述药材提取液，直接上大孔树脂I或者加水稀释后上大孔树脂I，依次 用水和体积百分比浓度50%~70%的乙醇溶液II洗脱，收集所述乙醇溶液II的洗脱液，回 收尽乙醇，浓缩至25 °C密度为1.5~3.5mg/mL的浓缩液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，收 集乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，干燥，得到乙酸乙酯部分;所述乙酸乙酯部分用体积百 分比浓度20%乙醇溶液III溶解至浓度为2.5~5.Omg/mL，上大孔树脂II，依次用体积百分 比浓度10%的乙醇溶液IV、体积百分比浓度20%的乙醇溶液III和体积百分比浓度30%的 乙醇V洗脱，收集所述乙醇溶液V洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得到混合物粗品； III.精制 将步骤II得到的混合物粗品用体积百分比浓度50%~70%甲醇溶液溶解，上Sephadex LH-20柱，用体积百分比浓度50 %甲醇洗脱，等体积收集流份，分别合并含量较高的细花香 茶菜苷A和咖啡酸乙酯流份，减压浓缩，1~10°C温度下静置结晶，分离结晶和母液，重结晶， 晶体干燥，得到细花线纹香茶菜苷A和咖啡酸乙酯。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述香茶菜属植物选自线纹香茶菜Isodon lophanthoides、细花线纹香茶菜Isodon lophanthoides var·graciliflora和狭基线纹香 茶菜Isodon Iophanthoides var · gerardianus(Benth· )Η·Hara中的一种或几种；更优选为 细花线纹香荼菜Isodon Iophanthoides var.grac i1i f1ora 〇3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤I中，所述香茶菜属植物干燥 地上部分用所述乙醇溶液I提取2~3次，每次所述乙醇溶液I的体积为所述香茶菜属植物干 燥地上部分重量的10~14倍;更优选为12倍； 优选的，所述步骤I中，所述乙醇溶液I的体积百分比浓度为40 %~70%，更优选为 50% ； 优选的，所述步骤I中，提取方法选自超声提取、加热回流提取和渗漉提取中的一种或 几种;更优选为超声提取，每次30~60分钟，更优选为40~50分钟。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤I的具体操作为： 取线纹香茶菜Isodon Iophanthoides、细花线纹香茶菜Isodon Iophanthoides var.graciliflora和狭基线纹香茶菜Isodon Iophanthoides var.gerardianus(Benth.) H.Hara中的一种或几种的干燥地上部分，用体积百分比浓度40%~70%的乙醇溶液I超声 提取3次，每次40~50分钟，每次所述乙醇溶液I的体积为药材重量10~14倍，过滤，合并滤 液，减压浓缩至25 °C密度1.5~5.0mg/mL，得到药材提取液； 优选的，所述步骤I的具体操作为： 取线纹香茶菜Isodon Iophanthoides、细花线纹香茶菜Isodon Iophanthoides var .graciliflora 和狭基线纹香茶菜 Isodon Iophanthoides var. gerardianus(Benth.) Η. Hara中的一种或几种的干燥地上部分，用体积百分比浓度50 %的乙醇溶液I超声提取3 次，每次40~50分钟，每次所述乙醇溶液I的体积为药材重量10~12倍，过滤，合并滤液，减 压浓缩至25 °C密度2.5mg/mL，得到药材提取液； 更优选的，所述步骤I的具体操作为： 取线纹香茶菜Isodon lophanthoides、细花线纹香茶菜Isodon lophanthoides var.graciliflora和狭基线纹香茶菜Isodon lophanthoides var.gerardianus(Benth.) H. Hara中的一种或几种的干燥地上部分，用体积百分比浓度50 %的乙醇溶液I超声提取3 次，每次40分钟，每次所述乙醇溶液I的体积为药材重量12倍，过滤，合并滤液，减压浓缩至 25 °C密度2.5mg/mL，得到药材提取液。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤II中，所述大孔树脂 I选自D101或AB-8;更优选为AB-8; 优选的，所述步骤II中，所述大孔树脂I与药材的重量比为1:1; 优选的，所述步骤II中，水的用量为大孔树脂I柱体积的8~12倍，更优选为10倍； 优选的，所述步骤II中，所述乙醇溶液II的体积百分比浓度为50% ; 优选的，所述步骤II中，所述乙醇溶液II的用量为大孔树脂I柱体积的6~10倍，更优选 为8倍。6. 根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤II中，所述浓缩液 依次用石油醚和乙酸乙酯各萃取4~8次;更优选6次； 优选的，所述步骤II中，每次萃取，所述浓缩液和石油醚的体积比为1:1~2;更优选为 1:1; 优选的，所述步骤II中，每次萃取，所述浓缩液和乙酸乙酯的体积比为1:1~2;更优选 为 1:1〇7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤II中，所述大孔树脂 II 选自 D101 或 AB-8; 优选的，所述步骤II中，所述大孔树脂II与药材的重量比为1:1; 优选的，所述步骤II中，所述乙醇溶液IV的用量为大孔树脂II柱体积的6~10倍;更优 选为8倍； 优选的，所述步骤II中，洗脱所述大孔树脂II时，所述乙醇溶液III的用量为大孔树脂 II柱体积的8~12倍;更优选为10倍； 优选的，所述乙醇溶液V的用量为大孔树脂II柱体积的6~8倍;更优选为6倍。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤II的具体操作为： 将步骤I得到的所述药材提取液上D101或AB-8大孔树脂，先用8~12倍柱体积的水洗 脱，再用6~10倍柱体积的体积百分比浓度50 %的乙醇溶液II洗脱，收集所述乙醇溶液II的 洗脱液，回收尽乙醇，浓缩至25 °C密度为1.5~3.5mg/mL的浓缩液;所述浓缩液先用体积1~ 2倍的石油醚萃取4~8次，弃去石油醚萃取液，再用体积1~2倍的乙酸乙酯萃取4~8次，合 并各次乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，干燥，得到乙酸乙酯部分;所述乙酸乙酯部分用体 积百分比浓度20%乙醇溶液III溶解至浓度为2.5~5.0mg/mL，上D101或AB-8大孔树脂，先 用6~10倍柱体积的体积百分比浓度10 %的乙醇溶液IV洗脱，再用8~12倍柱体积的体积百 分比浓度20 %的乙醇溶液IV洗脱，最后用6~8倍柱体积的体积百分比浓度30 %的乙醇洗脱 V，收集所述乙醇溶液V的洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得到混合物粗品。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤II的具体操作为： 将步骤I得到的所述药材提取液上AB-8大孔树脂，先用10倍柱体积的水洗脱，再用8倍 柱体积的体积百分比浓度50%的乙醇溶液II洗脱，收集所述乙醇溶液II的洗脱液，回收尽 乙醇，浓缩至25°C密度为1.5~3.5mg/mL的浓缩液;所述浓缩液先用等体积的石油醚萃取6 次，弃去石油醚萃取液，再用等体积的乙酸乙酯萃取6次，合并各次乙酸乙酯萃取液，回收乙 酸乙酯，干燥，得到乙酸乙酯部分;所述乙酸乙酯部分上D101或AB-8大孔树脂，先用8倍柱体 积的体积百分比浓度10 %的乙醇溶液IV洗脱，再用10倍柱体积的体积百分比浓度20 %的乙 醇溶液Π Γ冼脱，最后用6倍柱体积的体积百分比浓度30 %的乙醇洗脱V，收集所述乙醇溶液 V的洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得到混合物粗品。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤III中，步骤II得到 的所述混合物粗品用体积百分比浓度50%甲醇溶液溶解，配制成浓度为3. Omg/mL的溶液； 优选的，所述步骤ΠI中，每流份为50mL; 优选的，所述步骤III中，各流份用薄层层析法或高效液相色谱法检测成分;更优选用 高效液相色谱法检测成分。
【文档编号】C07H15/26GK106046076SQ201610489009
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】张慧晔, 唐海明, 王德勤, 李楚源
【申请人】广州白云山和记黄埔中药有限公司, 清远白云山和记黄埔穿心莲技术开发有限公司