一种固相合成dna编码化合物库的方法
【专利摘要】本发明公开了一种固相合成DNA编码化合物库的方法，它包括以下步骤：a、固相载体G?1与连接分子L?1反应，制备L?G?1；b、DNA与连接分子L?0反应，制备L?2；c、L?G?1与L?2反应，制备L?G?2；d、L?G?2脱去保护基团，得到L?G?2?1；e、与合成砌块反应，DNA编码；f、切除固相载体，得到DNA编码的化合物库。与现有方法相比，本发明方法只需要通过简单的几次过滤洗涤操作即可完成反应的后处理纯化，操作简便，使得合成DNA编码化合物库的生产周期缩短了50％以上，显著提高了DNA编码化合物库的生产效率与唯一性以及最终产物的纯度，经济价值高，非常适合产业上的应用。
【专利说明】
-种固相合成DNA编码化合物库的方法
技术领域
[0001 ]本发明设及一种固相合成DNA编码化合物库的方法。
【背景技术】
[0002] 在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物祀标的高通量筛选是快速获得先导化 合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、 库化合物数量有限(数百万），且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的 发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库合成技术，结合了组合化学和分子生物 学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，能在极短的时间内合成高达亿级的 化合物库。而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大 小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在国外制药行业广泛应用，产 生了诸多积极的效果(Accounts of Qiemical Research,2014,47,1247-1255)。
[0003] 由于在DNA编码的化合物库中的每个化合物分子都含有一个独特、给定的DNA序 列，化合物库的筛选过程是可W将千万甚至上亿的DNA编码化合物库作为一个整体，溶解在 几十个微升的体积中，使用常规实验室的条件完成对生物祀标的高通量筛选。相比传统的 高通量化合物筛选，无需使用昂贵的筛选设备和复杂的化合物库管理系统，极大地节约了 设备投入和筛选成本。
[0004] 1993年，Brenner等人受到遗传基因 DNA标志（genetic DNA 1:ag)的启发，利用微珠 编码(encoding of beads)技术，让每个微珠只黏附一种化合物，在合成的进程中将其"过 程"编码到微珠上，通过读取微珠上的编码W确定粘附在微珠上的化合物。运种固相条件下 的"DNA编码组合化学合成方法"发表在美国化学会志上(J. Am.化em.Soc. 1993,115,9812- 9813)"Brenner发表的方法局限于多肤库的合成，不能满足现代化药所需的多样小分子化 合物库的合成。
[0005] Pehr B.Harbu巧等人随后也发展了一种固相条件下DNA编码化合物库的合成方 法，并用于多肤的合成(PloS Biology 2004,2,1031-1038)。但其固相材料使用的是阴离子 交换树脂DEAE琼脂糖凝胶。固相载体与DNA之间的作用力主要来源于离子相互作用。它在高 浓度的盐体系里或其他影响离子相互作用的体系里很难稳定存在，运极大的限制了其在小 分子化合物库的合成中的应用。
[0006] 申请号：201210555548.3，发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂 盒"的专利申请公开了一种DNA编码化合物库的合成及编码技术:首先将DNA单链的始端序 列的一端连接在合成搁块上，另一端与合成搁块的特异性标记序列串联连接，得到标记有 一端游离的单链DNA的初始合成搁块;其次W得到的初始合成搁块为基础，用线性组合反应 的方式合成化合物。合成过程中，每加入新的合成搁块，就在与初始合成搁块相连的单链 DNA游离端串联连接所加入的合成搁块的特异性标记序列，使所述单链DNA逐渐延长;最后 在合成结束后，在所述单链DNA游离端串联连接末端序列，得到单链DNA标记的化合物文库。 该发明可W快速有效地合成并通过筛选、测序得到目的先导化合物。
[0007] 虽然现有的DM编码化合物库的合成及编码技术能很好的应用于先导药物的筛 选，但是其也存在一些不足和局限：1)在很大程度上，用于编码的DNA适用于水相(或含与水 互溶的有机溶剂的水相)反应，反应分子在纯有机溶剂中溶解度差，无法用于对水敏感的纯 有机相化学反应，限制了可用于DNA编码化合物库的合成反应类型，降低了 DNA编码化合物 库的合成化学反应的速率。2)为促使合成反应各步接近完全转化，DNA编码化合物库的合成 往往使用大大过量的小分子反应试剂，运些试剂很难从基于水相的DNA编码化合物库合成 体系中完全分离出来。3)基于液相反应的化合物DNA库在库合成过程中，为了达至化NA化合 物库的纯度要求，DNA库合成反应后的分离纯化步骤繁多且周期长。
[0008] 目前，现有固相条件下的"DNA编码组合化学合成方法"局限于多肤合成，适用的化 学反应类型比较有限。同时，固相载体与DNA之间的作用力主要来源于离子相互作用，它在 高浓度的盐体系里或其他影响离子相互作用的体系里很难稳定存在，也极大地限制了其在 小分子化合物库的合成中的应用。
[0009] 因此，需要寻找一种步骤简便、成本低、周期短并适合有机溶剂体系的固相合成 DNA编码化合物库的方法。
【发明内容】
[0010] 为了解决上述问题，进一步优化DNA编码化合物库的合成及纯化方法，增加 DNA编 码化合物库的化学小分子结构的多样性，扩大其在新药筛选中的应用范围，本发明公开了 一种固相合成DNA编码化合物库的方法。
[00川名词解释：
[0012]合成搁块(Synthetic Building Block)，又叫合成子，是指具备各种理化性质W 及特定生物化学性质的、在新药(西药、农药)研发过程中必须使用的小分子化合物。
[0013] 固相载体:是指固相反应中用于负载的固相物质。
[0014] 连接分子:也称为结合分子，是指将DNA、小分子化合物库和固相载体连接在一起 的具有某种特定官能团的化合物。
[0015] CPG(Controlled化re Glass)微孔玻璃小球，二氧化娃材质。CPG球体内部有很多 不规则的孔道，孔隙网络庞大，孔道的大小称为孔径，孔径稳定。
[0016] 本发明提供的一种固相合成DNA编码化合物库的方法，它包括W下步骤：
[0017] a、固相载体G-1与连接分子L-1反应，分离、纯化，得到L-G-1;
[0023] cUL-G-2脱去保护基团，得到L-G-2-1;[0024] e、采用方法1、方法2、方法3、方法4或者其任意的组合：
[001 引
[0019]
[0020]
[0021]
[0022]
[0025] 方法 1:
[0026] kG-2-l与r1反应，分离、纯化，得到心6-2-1-1;对心6-2-1-1进行0魁编码，得到心 G-3-I；
[0027]
[002引或者；
[0029] 方法 2:
[0030] i、L-G-2-l与骨架分子反应，分离、纯化，得到L-G-2-2;
[0031]
[0032] L-G-2-2-1;对 L-G-2-
[0033]
[0034] 或者；
[0035] 方法 3:
[0036] i、L-G-2-1与骨架分子反应，分罔、纯化，得到L-G-2-2;
[0037] ii、1^-6-2-2或心6-2-2脱去保护基团后，与r1反应，分罔、纯化，得到L-G-2-2-1;对 kG-2-2-l进行DNA编码，得到kG-3-l;
[003引 iii、心6-3-1或心6-3_1脱去保护基团后，与R2反应，分罔、纯化，得到kG-3-l_l; 对心6-3-1-1进行DNA编码，得到kG-3-2;
[0039]
[0040] 或者；
[0041] 方法 4:
[0042] i、kG-2-l与骨架分子反应，分离、纯化，得到kG-2-2;对心6-2-2进行DNA编码，得 至化-G-3-1;
[00创 ii、1^-6-3-1或心6-3-1脱去保护基团后，与R2反应，分罔、纯化，得到L-G-3-1-1;对 kG-3-1-l 进行 DNA 编码，得到kG-3-2;
[0044] 其中，Ri、R2为合成搁块；
[0045] f、切除レG-3-I、レG-3-巧日/或レG-3-2的固相载体，得到レD-T，即为DNA编码的化 合物库。
[0046] 进一步的，步骤a中，所述固相载体选自PEG树脂、PEGA树脂、无机物固相载体、阳薄 片中的任意一种或多种。
[0047] 进一步的，步骤a中，所述固相载体选自带有氨基活性官能团的固相载体;优选的， 所述固相载体为（
[004引进一步的，步骤a中，所述连接分子レl选自含有醋基、脂基、硫醋基、邻硝基苄基、 香豆素基团、芳香甲酬基团、叠氮、径基、琉基、琉酸基、簇基、醒基、氨基、胺基、酷胺基、締 基、烘基中任意一种或多种官能团的化合物；优选的，所述连接分子L-1为
[0049] 进一步的，步骤a中，固相载体G-1与连接分子的重量比为1:0.08~0.2;优选 的，固相载体G-1与连接分子的重量比为1:0.138。
[0050] 进一步的，步骤a中，反应溶剂为面控类溶剂;优选的，反应溶剂为二氯甲烧。
[0051 ] 进一步的，步骤a中，反应溫度为15~25r ;反应时间为12~16小时。
[0052]进一步的，步骤a中，分离、纯化的方法为:除去溶剂，得到固体，固体用DMF和二氯 甲烧洗涂，即可。
[0化3] 进一步的，步骤a中，所述L-G-1)
[0化4] 进一步的，步骤b中，所述DNA为单链DNA。
[0055] 进一步的，步骤b中，所述连接分子レ0选自含有醋基、脂基、硫醋基、邻硝基苄基、 香豆素基团、芳香甲酬基团、叠氮、径基、琉基、琉酸基、簇基、醒基、氨基、胺基、酷胺基、締 基、烘基中任意一种或多种官能团的化合物;优选的，所述连接分子心〇为
[0056] 进一步的，步骤b中，反应是在缩合剂的条件下进行。
[0057] 进一步的，步骤b中，所述缩合剂为2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-=嗦。
[005引进一步的，步骤b中，DNA与连接分子kO的摩尔比为1:50~300,连接分子心0与缩 合剂的摩尔比为1:1~2;优选的，DNA与连接分子kO的摩尔比为1:100,连接分子心0与缩合 剂的摩尔比为1:1。
[0059] 进一步的，步骤b中，反应溫度为15~25°C ;反应时间为12~16小时。
[0060] 进一步的，步骤b中，分离、纯化的方法为：调节pH = 4~5，加入乙醇，于-20°C下沉 淀后，离屯、，得到固体，洗涂，即可。
[0061 ] 进一步的，步骤b中，所述心巧
[0062] 进一步的，步骤C中，反应是在有机溶剂的条件下进行;优选的，反应是在化晚的条 件下进行。
[0063] 进一步的，步骤C中，L-G-1与心2的摩尔比为2~10:1，L-G-1与化晚的重量体积比 为1:0.8~2.5mg/化;优选的，L-G-1与L-2的摩尔比为5:1，kG-1与化晚的重量体积比为1: Im邑/化。
[0064] 进一步的，步骤C中，反应溫度为20~45。反应时间为14~30小时;优选的，反应 溫度为40°C;反应时间为2化。
[0065] 进一步的，步骤c中，分离、纯化的方法为:除去溶剂，得到固体，固体用水和TEAA缓 冲溶液洗涂，即可。
[0066] 进一步的，步骤C中，所述kG-2为
[0067] 进一步的，步骤d中，所述保护基团为氨基保护基团；优选的，所述保护基团为巧甲 氧幾基。
[0068] 进一步的，步骤d中，L-G-2是在赃晚、含氮类溶剂的条件下脱去保护基团，其中，所 述心6-2与赃晚的摩尔体积比为1:100~1 OOOOmo 1 /L，所述赃晚与含氮类溶剂的体积比为1 ~4:5~20。
[0069] 进一步的，步骤d中，所述L-G-2-1为 [0070；
[0071 ] 进一步的，步骤e中，DNA编码的方法为:标记序列i串联连接在心6-2-1-1、心6-2- 2-1、心6-3-1-1或心6-2-2的DNA上，标记序列i特异标记Ri，其中，Ri为合成搁块，i = 1，2;合 成过程中，每加入新的R1，就在DNA或标记序列（i-1)上串联连接标记序列i，合成结束后，在 标记序列i上连接末端序列，即可。
[0072] 进一步的，步骤e中，所述Ri、R2分别或同时选自多官能团化合物，多官能团独立地 选自氨基、簇基、醒基、締基、烘基、面素、叠氮、径基、琉基、苯基中的任意两种或两种W上； 优选的，所述Ri、R2分别或同时选自氨基酸、取代或未取代的二簇酸、取代或未取代的二胺、 取代或未取代的締控、取代或未取代的烘控、取代或未取代的醒、异氯酸醋;更优选的，所述 Ri、R2分别或同时选自异氯酸醋、节醇或苯甲酸。
[0073] 进一步的，步骤e中，所述骨架分子含有径基、氨基、簇基、氯基、醒基中的任意一种 或两种W上。
[0074] 进一步的，步骤e中，所述骨架分子选自对径基苯丙酸、对氨基苯甲酸、对径基苯甘 氨酸、N-巧甲氧幾基-甘氨酸、N-巧甲氧幾基-心苯丙氨酸、叔下基异腊、环己烷基异腊、3-甲 基下醒、环戊烷基酵
的任意一种或两种W上。
[0075] 进一步的，步骤e的方法1中，反应是在有机胺和有机溶剂的条件下进行;优选的， 反应是在S乙胺和N，N-二甲基甲酯胺的条件下进行。
[0076] 进一步的，步骤e的方法1中，L-G-2-URi、有机胺的摩尔比为1:50~500:50~500， kG-2-l与有机溶剂的摩尔体积比为1:50~500nmol/化;优选的，kG-2-l、Ri、有机胺的摩 尔比为1:150:150，L-G-2-l与有机溶剂的摩尔体积比为1:240nmolAiL。
[0077] 进一步的，步骤e的方法1中，反应溫度为25°C~30°C，反应时间为12h~16h。
[0078] 进一步的，步骤e的方法1中，分离、纯化的方法为：除去溶剂，得到固体，固体用水 和TEAA缓冲溶液洗涂，即可。
[0079] 进一步的，步骤e的方法2或方法3中，步骤i的反应是在缩合剂、有机胺和有机溶剂 的条件下进行;步骤e的方法4中，步骤i的反应是在有机溶剂的条件下进行;优选的，反应是 在2-(7-偶氮苯并S氮挫）-N，N，N'，N'-四甲基脈六氣憐酸醋、N，N-二异丙基乙胺和含氮类 溶剂的条件下进行；
[0080] 所述レG-2-l、骨架分子、缩合剂与有机胺的摩尔比为1: 50~500: 50~500: 50~ 500;所述化合物L-G-2-1与含氮类溶剂的摩尔体积比为50~SOOnmol/iiL。
[0081] 进一步的，步骤e的方法2或方法3或方法4中，步骤i的反应溫度为25°C~30°C;反 应时间为12h~16h。
[0082] 进一步的，步骤e的方法2或方法3或方法4中，步骤i分离、纯化的方法为：除去溶 剂，得到固体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涂，即可。
[0083] 进一步的，步骤e的方法2或方法3或方法4中，步骤ii的反应是在有机胺或有机麟 和有机溶剂的条件下进行;优选的，所述有机胺选自N，N-二异丙基乙胺或S乙胺;所述有机 麟选自=苯基麟;所述有机溶剂选自面控类溶剂、酸类溶剂或含氮类溶剂;优选的，所述酸 类溶剂选自四氨巧喃;所述含氮类溶剂选自N，N-二甲基甲酯胺。
[0084] 进一步的，步骤e的方法2或方法3或方法4中，步骤ii的反应溫度为25°C~30°C;反 应时间为12h~16h。
[0085] 进一步的，步骤e的方法2或方法3或方法4中，步骤ii分离、纯化的方法为：除去溶 剂，得到固体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涂，即可。
[0086] 进一步的，步骤e的方法2、方法3或方法4中，1-6-2-2或心6-3-1脱去保护基团的方 法为:L-G-2-2或L-G-3-1中加入赃晚，于25 °C~30°C揽拌反应化~化，除去溶剂，得到固体， 固体用水和TEAA缓冲溶液洗涂，即可。
[0087] 进一步的，步骤e的方法3或方法4中，与R2反应是在有机胺和有机溶剂的条件下进 行;优选的，所述有机胺选自N，N-二异丙基乙胺或S乙胺，有机溶剂选自面控类溶剂。
[0088] 进一步的，步骤e的方法3或方法4中，与R2反应的反应溫度为25°C~30°C，反应时 间为1化~16h。
[0089] 进一步的，步骤e的方法3或方法4中，步骤iii中分离、纯化的方法为:除去溶剂，得 至晒体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涂，即可。
[0090] 进一步的，步骤e中，
[0091] 所述 L-G-3-巧
[0092] 所述 L-G-2-2^
[0093] 所述 L-G-3-l^
[0094]
[OOM]其中，为可w形成异氯酸醋的基团。
[0096] 进一步的，步骤f中，切除固相载体的方法为：
[0097] ①、取L-G-3-I、L-G-3-l和/或L-G-3-2,加入碱，反应，分罔、纯化，即可；
[009引或者；
[0099] ②、取kG-3-I、kG-3-l和/或心6-3-2，加入PBS缓冲溶液，光源下进行分解反应， 分离、纯化，即可。
[0100] 进一步的，①中，所述碱选自有机碱或无机碱;反应溫度为30~60°C;反应时间为1 ~10小时;优选的，所述无机碱为氨水;反应溫度为55°C;反应时间为1小时。
[0101] 进一步的，②中，光源的波长为365皿;分解反应的反应溫度为25°C~40°C;反应时 间为化~化。
[0102] 进一步的，①和/或②中，分离、纯化的方法为：用水和TEAA缓冲溶液洗涂，得到滤 液;将滤液浓缩后，加入乙醇，于-20°C下沉泣后，离如，得到岡体，親燦，即可。
[0103] 进一步的，步骤f中，所述L-D-巧
[010^
[01化]其中，RJ为可W形成异氯酸醋的基团；Ri-a为C出或C6也C出CH;Ri-b为正下基、异下基、 叔下基或环己烷基;Ri-。为正丙基、异丙基或环戊烷基;Rk为簇酸、醒、异氯酸醋中的任意一 种与氨基反应生成的基团。
[0106]本发明还提供了一种DNA编码化合物库，它具有式I所示的通式：
[0107： 武1
[010引 其中，
[0109]
3化合物库的骨架分子；
[0110] R1'选自氨或合成搁块；
[0111] E选自胺基、締基、烘基、酷胺基、脂基、琉酸基或叠氮；
[0112] A选自径基、琉基；
[0113] B选自 R为氨、Cl~C8 ，. 烷基、Cl~C8締基或与Bi中的原子成环;Bi选自取代或未取代的烘基、氨基、簇基、醒基、叠氮 或琉基?
[0114]
I 示 DNA。
[0115] 进一步的，所述骨架分子含有径基、氨基、簇基、氯基、醒基中的任意一种或两种W 上。
[0116] 进一步的，所述骨架分子选自对径基苯丙酸、对氨基苯甲酸、对径基苯甘氨酸、N- 巧甲氧幾基M-心甲氧幾基-心苯丙氨酸、叔下基异腊、环己烷基异腊、3-甲基下醒、 环戊烷基醒 中的任意一种或两种W上。
[0117] 进一步的，A的长度为10个~50个原子。
[011引进一步的，它包括W下DNA编码化合物片
[01
[0120] 其中，Rj为可W形成异氯酸醋的基团；Ri-a为C出或C6也C出CH;Ri-b为正下基、异下基、 叔下基或环己烷基;Ri-。为正丙基、异丙基或环戊烷基;Rk为任何簇酸、醒、异氯酸醋中的任 意一种与氨基反应生成的基团。
[0121] 与现有液相合成DNA编码化合物库的方法相比，本发明方法只需要通过简单的几 次过滤洗涂操作即可完成反应的后处理纯化，操作简便，使得合成DNA编码化合物库的生产 周期缩短了50% W上，显著提高了DNA编码化合物库的生产效率与唯一性W及最终产物的 纯度，经济价值高，非常适合产业上的应用。
[0122] 具体举例，进一步说明本发明的技术方案：
[0123] (1)、向G-1 (0.5g,负载量：32皿ol/g)中加入3血含有化合物(69mg,0.1 mmol;生 产厂家:Aldrich)的二氯甲烧溶液，置于室溫下反应过夜;反应完毕后，过滤移除溶剂，得到 固体；固体分别用DMF(2mL X 3)和二氯甲烧(2mL X 3)洗涂，直至LC-MS检测滤液中不含化合 物心1，得到kG-l。
[0124] 取部分L-G-1，用赃晚移除Fmoc保护基，利用游离氨基的紫外吸收定量，确定CPG负 载量为14.5皿ol/g。
[01巧](2)将单链DNA溶于30化化HC化缓冲溶液中，依此加入20ml的レ0 (1. Omg，3 .化 mol;生产厂家:A1化ich)的DMS0溶液、10化DMT-MM(0.83mg，3.0皿〇1)的水溶液，置于室溫 下反应过夜；反应完毕后，加入3M HC1溶液调节抑=4~5，加入24化L乙醇，置于-20°C下沉 淀2小时后离屯、，得到固体;固体用85 %乙醇洗涂一次，得到心2。
[0126] (3)向kG-l (1 Omg，140nmo 1)中加入90化含有心2 (2加 mo 1)的水溶液和10化化晚， 置于40°C下揽拌反应21小时;反应完毕后，过滤移除溶剂，得到固体；固体分别用蒸馈水和 0.1M TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2。
[0127] (4)向心6-2中加入含氮类溶剂和赃晚，于25°C~30°C揽拌反应4h~化;反应完毕 后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M TEAA缓冲溶液洗涂S次，得到kG- 2-1 D
[01%]所述L-G-2与赃晚的摩尔体积比为1:(1~4)mol/ml;所述赃晚与含氮类溶剂的体 积比为（1~4): (5~20);
[0129] (5)向心6-2-1中加入带有簇酸官能团的骨架分子、2-(7-偶氮苯并S氮挫）-N，N， N'，N'-四甲基脈六氣憐酸醋、N，N-二异丙基乙胺和面控类溶剂，于25°C~30°C揽拌反应12h ~16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M TEAA缓冲溶液洗涂=次，得 菌JL-G-2-2.a。
[0130] 所述kG-2-l、带有簇酸官能团的骨架分子、2-(7-偶氮苯并S氮挫）-N，N，N'，N'- 四甲基脈六氣憐酸醋与N，N-二异丙基乙胺的摩尔比为1: (1~2): (1~2): (2~4);所述化合 物L-G-2-1与面控类溶剂的质量体积比为1: (9~20)g/ml;
[0131] (6)向心6-2-2.曰中加入护(护为合成切块，可^选自异氯酸醋、节醇或苯甲酸，王= 1、2或3)、N，N-二异丙基乙胺和面控类溶剂，于25°C~30°C揽拌反应12h~16h后，过滤移除 溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2-2-1. a;
[0132] 在每步合成搁块化学反应纯化完成后，均采用申请号：201210555548.3，发明名 称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"的专利申请公开的DNA编码技术对本发 明化合物库的R1、R2、R3对应进行生物酶催化的DNA编码，得至化-G-3-1. a。
[0133] (7)用碱或光切除的方法将心6-3-1. a中的CPG切除，得至化NA编码的化合物库心〇- T-1。
[0134] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0135] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0136] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0137] 缩写；
[0138] Fmoc:巧甲氧幾基;DMF: N，N-二甲基甲酯胺;DMS0:二甲基亚讽;DMT-MM: 2-氯-4，6- 二甲氧基-1，3,5-S嗦;TEAA:乙酸S乙胺;DIEA:N，N-二异丙基乙胺。
[0139] 实施例1
[0140] (l)、L-G-l 的制备 「01411
LUI心」 问b-UU.日g，Wb胆瓶巧颗重：皿oi/g，米微、：王巧俊化头业及化巧限公巧；中加 入3mL含有化合物(69mg，0.1 mmol;生产厂家:A1化ich)的二氯甲烧溶液，置于室溫下反 应过夜;反应完毕后，过滤移除溶剂，得到固体；固体分别用DMF(2mLX3)和二氯甲烧(2mLX 3)洗涂，得到L-G-1。
[0143] 取心6-1，用赃晚移除化oc保护基，利用化oc的消除产物的紫外吸收定量，确定k 6-1负载量为14.5皿〇1/邑，产率91%。
[0144] (2)、L-2 的制备
[014!
[0146] 将单链D N A ( 3 2 . 0 n m 0 1，分子量7 6 6 3 . 9 )(单链D N A的序列为 GGAGCTTGTGAATTCTGGCACTCG)溶于30化化HC03缓冲溶液中，依此加入20ml的レ0a .Omg， 3.0皿01;生产厂家:A1化i ch)的DMS0溶液、10化的DMT-MM( 0.83mg，3.0皿01)的水溶液，置于 室溫下反应过夜;反应完毕后，加入3M的肥1溶液调节抑=4~5，加入24化L乙醇，置于-20°C 下沉淀2小时后离屯、，得到固体；固体用85%乙醇洗涂一次，得到。使用0D紫外吸收定量， 确定物质的量为28. Onmol，产率80 %。
[0147] MS化SI)m/z 7979.6(M+1)+。
[014 引（3)、L-G-2 的制备
[0150] 向心6-1 (lOmg，140nmol)中加入90此含有k2(28nmol)的水溶液和10化化晚，置于 40°C下揽拌反应21小时；反应完毕后，过滤移除溶剂，得到固体；固体分别用蒸馈水和0.1M 的TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2。
[0151] (4)、L-G-2-l 的制备 「/"H KOI
123 向心6-2(8.〇111邑）中加入DMF(160化）和赃晚（40化），于25°C~30°C揽拌反应化；反 应完毕后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂=次， 得到 L-G-2-1。 2 取部分kG-2-l(3.0mg)加入15化L浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相载体， 过滤后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L乙醇和 100化醋酸-醋酸钢缓冲液(抑二4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到DNA组分。使用0D紫外吸收定 量，确定kG-2-l中DNA物质的量为6. Onmol，产率65 %。 3 MS化SI)m/z 8251.0(M+1)+。
[0156] (5)、L-G-2-2.a 的制备
[0157]
[0158] 向心6-2-1中加入带有簇酸官能团的骨架分子、2-(7-偶氮苯并S氮挫）-N，N，N'， N'-四甲基脈六氣憐酸醋、DIEA和DMF，于25°C~30°C揽拌反应1化后，过滤移除溶剂，得到滤 饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2-2. a。
[0159] 具体的，
[0160] 向kG-2-l (20mg)中加入对氨基苯甲酸(生产厂家:Alf a，4.15mg)、2-(7-偶氮苯并 S氮挫）-N，N，N'，N'-四甲基脈六氣憐酸醋（生产厂家:Alfa，6.9mg)、DIEA(20iiLWPDMF(60ii L)，于25°C~30°C揽拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的 TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2-2. a。
[0161] 取部分kG-2-2.a(3.0mg)，加入150化浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相载 体，过滤后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L乙 醇和10化L醋酸-醋酸钢缓冲液(抑二4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到DNA组分。使用0D紫外吸 收定量，确定kG-2-2-2. a中DNA物质的量为4.5nmol，产率75%。
[0162] MS化SI)m/z 8369.7(M+ir。
[0163] (6)、L-G-3-l.a 的制备
[0164]
[0165] 向1^-6-2-2.a中加入Rj '（Rj '为合成搁块，选自Rj取代的异氯酸醋）、DIEA和DMF，于 25°C~30°C揽拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和O.IM的TEAA缓 冲溶液洗涂=次，得到L-G-2-2-1. a;
[0166] L-G-2-2-l.a参照发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"（申请 号：201210555548.3)中所述的DNA编码方法进行固相条件下的DNA编码(单链DNA的序列为 GGAGCTTGTGAAGGCTGGCACTCG)，得到L-G-3-1 .a;
[0167] 编码结束后，固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液(4X10化L)和蒸馈水(4X10化L)洗 涂，最后用10化L蒸馈水洗涂;洗涂结束后，取部分固体，加入50化氨水，置于55 °C下反应1小 时；固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液和蒸馈水洗涂S次；将得到的滤液进行乙醇沉淀，冻 干，用于琼脂糖电泳检测。
[016引（7)、L-D-T-1化合物库合成
[0169]
[0170] 用碱或光切除的方法将心6-3-1 .a中的CPG切除，得到DNA编码的化合物库心0-1'- 1〇
[0171] 实施例2
[01巧 （1)按照实施例1中心6-1的制备方法，得至化-G-1;
[0173] (2)按照实施例1中心2的制备方法，得到心2;
[0174] (3)按照实施例1中kG-2的制备方法，得到kG-2;
[0175] (4)按照实施例1中L-G-2-1的制备方法，得到L-G-2-1;
[0176] (5 化-G-3-l.b 的制备
[0177]
[017引向心6-2-1(5.0111邑）中加入2-乙基苯异氯酸醋（1.47mg;生产厂家:Alfa)、^乙胺（5 化)和DMF(15化），于25°C~30°C反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和 0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂S次，得到L-G-2-1-1. b;
[0179] 取部分kG-2-1-l.b(2.0mg)加入150化浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相载 体，过滤后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L乙 醇和10化L醋酸-醋酸钢缓冲液(抑=4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到DNA组分。使用0D紫外吸 收定量，确定kG-2-1-l.b中DNA物质的量为2.5nmol，产率63%。
[0180] MS化SI)m/z 8395.4(M+1)+。
[0181] L-G-2-1-l.b参照发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"（申请 号：201210555548.3)中所述的DNA编码方法进行固相条件下的DNA编码(单链DNA的序列为 GGAGCTTGTGAACCCTGGCACTCG)，得到L-G-3-1 .b;
[0182] 编码结束后，固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液(4X10化L)和蒸馈水(4X10化L)洗 涂，最后用10化L蒸馈水洗涂;洗涂结束后，取部分固体，加入50化氨水，置于55 °C下反应1小 时；固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液和蒸馈水洗涂S次；将得到的滤液进行乙醇沉淀，冻 干，用于琼脂糖电泳检测。
[0183] (6)按照类似实施例l4^kD-T-l的制备方法，得至化-D-T-2。
[0184
[01化]实施例3
[0186] (1)按照实施例1中L-G-1的制备方法，得到L-G-1;
[0187] (2)按照实施例1中心2的制备方法，得到心2;
[018引（3)按照实施例1中L-G-2的制备方法，得到L-G-2;
[0189] (4)按照实施例1中L-G-2-1的制备方法，得到L-G-2-1;
[0190] (5 化-G-2-2.C 的制备
[0191]
[0192]向心6-2-1(2〇111邑）中加入对氨基苯甲酸(4.15mg，生产厂家:Alfa)、2-(7-偶氮苯并 S氮挫)-N，N，N'，N'-四甲基脈六氣憐酸醋(6.9mg，生产厂家:Alfa)、DIEA(20化)和DMF(60ii L)，于25°C~30°C揽拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的 TEAA缓冲溶液洗涂二次，得到L-G-2-2. C;
[0193] 取部分kG-2-2.c(2.0mg)加入150化浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相载 体，过滤后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L乙 醇和10化L醋酸-醋酸钢缓冲液(抑=4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到DNA组分。使用0D紫外吸 收定量，确定kG-2-2. C中DNA物质的量为3. Onmol，产率75%。
[0194] MS化SI)m/z 8369.7(M+1)+。
[0195] (6 化-G-3-1.C 的制备 [01961
[0197] 向レG-2-2.ca0mg)中加入苯甲酸（2.0mg)、2-(7-偶氮苯并S氮挫）-N，N，N'，N'- 四甲基脈六氣憐酸醋(6.9mg，生产厂家:Alfa)、DIEA(2化L)和DMF(60化），于25°C~30°C揽 拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂S 次，得到 L-G-2-2-1. c;
[0198] 取部分kG-2-2-l.c(2.0mg)加入150化浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相载 体，过滤后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L乙 醇和10化L醋酸-醋酸钢缓冲液(抑二4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到DNA组分。使用0D紫外吸 收定量，确定kG-2-2-l. C中DNA物质的量为1.5nmol，产率38%。
[0199] MS化SI)m/z 8473.1(M+1)+。
[0200] L-G-2-2-1.c参照发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"（申请 号：201210555548.3)中所述的DNA编码方法进行固相条件下的DNA编码(单链DNA的序列为 GGAGCTTGTGAAATCTGGCACTCG)，得到L-G-3-1. C;
[0201] 编码结束后，固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液(4X10化L)和蒸馈水(4X10化L)洗 涂，最后用10化L蒸馈水洗涂;洗涂结束后，取部分固体，加入50化氨水，置于55 °C下反应1小 时；固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液和蒸馈水洗涂S次；将得到的滤液进行乙醇沉淀，冻 干，用于琼脂糖电泳检测。
[0202] (7)按照类似实施例1中L-D-T-1的制备方法，得至化-D-T-3。
[020
12345678 实施例4 2
[020引（1)按照实施例1中心6-1的制备方法，得至化-G-1; 3 (2)按照实施例1中心2的制备方法，得到心2; 4 (3)按照实施例1中kG-2的制备方法，得至化-G-2; 5 (4)按照实施例1中L-G-2-1的制备方法，得到L-G-2-1; 6 (5 化-G-2-2.d 的制备 7
8 向心6-2-1 (20mg)中加入S-2( 17.4mg，生产厂家:Alfa)、2-(7-偶氮苯并S氮挫）- N，N，N'，N'-四甲基脈六氣憐酸醋(6.9mg，生产厂家:Alfa)、DIEA(20化)和DMF(60化），于25 °C~30°C揽拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲 溶液洗涂=次，得到L-G-2-2. d;
[0212] 取部分kG-2-2.d(2.0mg)加入150化浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相载 体，过滤后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L乙 醇和10化L醋酸-醋酸钢缓冲液(抑二4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到DNA组分。使用0D紫外吸 收定量，确定kG-2-2. d中DNA物质的量为2. Onmol，产率50%。
[0213] MS化SI)m/z 8698.0(M+1)+。
[0214] (6)、L-G-3-l.d 的制备
[0215]
[0216] 向心6-2-2.d( 15mg)中加入赃晚(40化），于25°C~30°C揽拌反应6h后，过滤移除溶 剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到固体；固体中加入 Rj'（Rj'选自Rj取代的异氯酸醋，1.5mg)、S乙胺（10化)和DMFa00化），于25°C~3(rC反应 1化后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂S次，得到 L~G~2~2~1.d；
[0217] L-G-2-2-l.d参照发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"（申请 号：201210555548.3)中所述的DNA编码方法进行固相条件下的DNA编码(单链DNA的序列为 GGAGCTTGTGAATACTGGCACTCG)，得到L-G-3-1 .d;
[021引编码结束后，固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液(4X100iiL)和蒸馈水(4X100iiL)洗 涂，最后用10化L蒸馈水洗涂;洗涂结束后，取部分固体，加入50化氨水，置于55 °C下反应1小 时；固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液和蒸馈水洗涂S次；将得到的滤液进行乙醇沉淀，冻 干，用于琼脂糖电泳检测。
[0219] (7)、L-D-T-4化合物库合成 帷，
[0221] 取心6-3-1.(1(1〇111旨)加入150化浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相载体，过滤 后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L乙醇和10化 L醋酸-醋酸钢缓冲液(抑二4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到L-D-T-4。
[0222] 实施例5
[0223] (1)按照实施例1中L-G-1的制备方法，得到L-G-1;
[0224] (2)按照实施例1中的制备方法，得到;
[0225] (3)按照实施例1中kG-2的制备方法，得到kG-2;
[0。6] (4)按照实施例1中L-G-2-1的制备方法，得到L-G-2-1;
[0227] (5 化-G-2-2.6 的制备
[02巧]向L-G-2-1中加入S-US-2和S-3W及DMF，于25~3(TC揽拌反应16h后，过滤移除溶 剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2-2. e。
[0230] 具体的，
[0231] 向心6-2-1 (20mg)中加入N-巧甲氧幾基-甘氨酸（S-1)(生产厂家:Alfa, 14.8mg)、 叔下基异腊（S-2)(生产厂家:4^日，4.2111旨）、3-甲基下醒（5-3)(生产厂家:4^日，4.3111旨）、和 DMF(100化），于25°C~30°C揽拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和 0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2-2. e;
[0232] 取部分上述kG-2-2.e(2mg)，加入150化浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相 载体，过滤后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L 乙醇和10化L醋酸-醋酸钢缓冲液(抑二4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到DNA组分。使用0D紫外 吸收定量，确定kG-2-2. e中DNA物质的量为38nmol，产率76%。
[0233] MS化SI)m/z 9111.4(M+ir。
[0234] (6)、L-G-3_1. e的制备 「09351
12 L-G-2-2 . e参照发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"（申请 号：201210555548.3)中所述的DNA编码方法进行固相条件下的DNA编码(单链DNA的序列为 GGAGCTTGTGAACGCTGGCACTCG)，得到kG-2-2-l. e;编码结束后，固体分别用0.1M的TEAA缓冲 溶液(4 X 10化L)和蒸馈水(4 X 10化L)洗涂，最后用10化L蒸馈水洗涂;洗涂结束后，取部分 固体，加入50化氨水，置于55°C下反应1小时；固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液和蒸馈水洗 涂=次;将得到的滤液进行乙醇沉淀，冻干，用于琼脂糖电泳检测； 2 向心6-2-2-1.6(1〇111邑）中加入赃晚(40化），于25°C~30°C揽拌反应化后，过滤移除 溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0 . IM的TEAA缓冲溶液洗涂S次，得到固体；固体加入 Rk'（可选自官能团带簇酸、醒基或异氯酸醋的合成搁块）、2-(7-偶氮苯并S氮挫)-N，N，N'， N'-四甲基脈六氣憐酸醋(6.1mg，生产厂家:Alfa)、DIEA(20化)和DMF(60化），于25°C~30°C 揽拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼，滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂 二次，得到 L-G-3-1-1. e;
[0238] L-G-3-1-1.e参照发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"（申请 号：201210555548.3)中所述的DNA编码方法进行固相条件下的DNA编码(单链DNA的序列为 GGAGCTTGTGAAGCCTGGCACTCG)，得到L-G-3-1. e;编码结束后，固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶 液(4 X 100化)和蒸馈水(4 X 100化)洗涂，最后用100化蒸馈水洗涂;洗涂结束后，取部分固 体，加入50化氨水，置于55°C下反应1小时；固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液和蒸馈水洗涂 =次;将得到的滤液进行乙醇沉淀，冻干，用于琼脂糖电泳检测；
[0239] (7)、L-D-T-5化合物库合成
[0240]
[0241] 取心6-3-1. e(2mg)，加入氨水(4化L)，置于55°C下反应化，固体分别用蒸馈水和 0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂数次，得到滤液;滤液浓缩，加入适量乙醇，置于-20°C下沉淀化后 离屯、，得到固体;固体用85 %乙醇洗涂一次，得至化NA编码的化合物库心0-1'-5。
[0242] 实施例6
[02创 （1)按照实施例1中心6-1的制备方法，得至化-G-1;
[0244] (2)按照实施例1中1^-2的制备方法，得到L-2;
[0245] (3)按照实施例1中kG-2的制备方法，得到kG-2;
[0246] (4)按照实施例1中L-G-2-1的制备方法，得到L-G-2-1;
[0247] (5 化-G-2-2.f 的制备 「rmsl
[0249]向心6-2-1中加入S-US-2和S-3W及DMF，于25~30°C揽拌反应16h后，过滤移除溶 剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2-2. f。
[0巧日]具体的，
[0巧。向1^-6-2-1(20111邑）中加入N-巧甲氧幾基-1^-苯丙氨酸（S-1)(生产厂家：Alfa, 15.1111旨）、环己烷基异腊(5-2)(生产厂家:4^日，4.8111旨）、环戊烷基醒(5-3)(生产厂家:4^日， 4. Img)、和DMF( 100化），于25°C~30°C揽拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼;滤饼分别 用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂=次，得到L-G-2-2. f;
[0252] 取部分上述kG-2-2.f(2mg)，加入15化L浓氨水，加热至55°C反应1小时切除固相 载体，过滤后减压蒸除溶剂，固体分别用0.1M的TEAA缓冲液和蒸馈水洗涂S次。加入25化L 乙醇和10化L醋酸-醋酸钢缓冲液(抑二4.7，0.5M)在-20°C下沉淀得到DNA组分。使用0D紫外 吸收定量，确定レG-2-2.f中DNA物质的量为35nmol，产率70%。
[0巧3] MS化SI)m/z 9241.9(M+1) +。
[0 巧 4] (6)、L-G-3-l.f 的制备 「0 巧51
[0256] L-G-2-2.f参照发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"（申请 号：201210555548.3)中所述的DNA编码方法进行固相条件下的DNA编码(单链DNA的序列为 GGAGCTTGTGAACGATGGCACTCG)，得到kG-2-2-l. f;编码结束后，固体分别用0.1M的TEAA缓冲 溶液(4 X 10化L)和蒸馈水(4 X 10化L)洗涂，最后用10化L蒸馈水洗涂;洗涂结束后，取部分 固体，加入50化氨水，置于55°C下反应1小时；固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液和蒸馈水洗 涂=次;将得到的滤液进行乙醇沉淀，冻干，用于琼脂糖电泳检测；
[0巧7] 向レG-2-2-l.f(10mg)中加入赃晚(40化），于25。(：~3(TC揽拌反应化后，过滤移除 溶剂，得到滤饼;滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂S次，得到固体；固体加入 Rk'（可选自官能团带簇酸、醒基及异氯酸醋的合成搁块）、2-(7-偶氮苯并S氮挫)-N，N，N'， N'-四甲基脈六氣憐酸醋(6.1mg，生产厂家:Alfa)、DIEA(20化)和DMF(60化），于25°C~30°C 揽拌反应16h后，过滤移除溶剂，得到滤饼，滤饼分别用蒸馈水和0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂 S次，得到 L-G-3-1-l.f;
[0258] L-G-3-1-l.f参照发明名称："一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒"（申请 号：201210555548.3)中所述的DNA编码方法进行固相条件下的DNA编码(单链DNA的序列为 GGAGCTTGTGAAGCGTGGCACTCG)，得到L-G-3-1. f;编码结束后，固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶 液(4 X 100化)和蒸馈水(4 X 100化)洗涂，最后用100化蒸馈水洗涂;洗涂结束后，取部分固 体，加入50化氨水，置于55°C下反应1小时；固体分别用0.1M的TEAA缓冲溶液和蒸馈水洗涂 =次;将得到的滤液进行乙醇沉淀，冻干，用于琼脂糖电泳检测；
[0259] (7KL-D-T-6化合物库合成
[o%1 ] 取心6-3-1. f (2mg)，加入氨水(4化L)，置于55°C下反应化，固体分别用蒸馈水和 0.1M的TEAA缓冲溶液洗涂数次，得到滤液;滤液浓缩，加入适量乙醇，置于-20°C下沉淀化后 离屯、，得到固体;固体用85 %乙醇洗涂一次，得至化NA编码的化合物库心0-1'-6。
[0262] 本发明方法可W实现在有机溶剂体系下DNA编码化合物库的合成，使在传统液相 条件下DNA编码化合物库合成中无法实现的或合成效率较低的化学反应能够顺利进行反 应，进一步地扩充编码化合物库的化学反应类型和化合物库多样性空间，扩充的反应类型 包括:有机催化的径醒缩合反应、締控复分解反应等，运些反应在传统的液相体系下DNA编 码化合物库合成中效率极低，采用本发明方法能显著的提高其合成效率。
[0263] 与现有液相合成DNA编码化合物库的方法相比，通过本发明CPG负载DNA编码化合 物合成技术，只需要通过简单的几次过滤洗涂操作即可完成反应的后处理纯化，简化了化 学合成反应和DNA编码反应的后处理，简化了分离纯化流程;使DNA编码化合物库合成周期 缩短了50% W上，大大节约了成本;显著提高了纯化质量，提高了DNA编码的效率与唯一性 W及最终产物的纯度。
[0264] 本发明DNA编码化合物库的合成方法，有利于除去过量的DNA，降低了 DNA编码化合 物库合成过程中过量的DNA所造成的对后续筛选等工作的干扰，大大提高了新药筛选的祀 向性和准确性。
[0265] 本发明选择的连接分子，使CPG、DNA和小分子之间W合适的距离进行连接，各个功 能块之间的分子键既可W在溫和条件下形成，又能在溫和条件下断开，实现了多种化学反 应在DNA和CPG共同存在下可W顺利进行。
【主权项】
1. 一种固相合成DNA编码化合物库的方法，其特征在于:它包括以下步骤： a、 固相载体G-1与连接分子L-1反应，分尚、纯化，得到L-G-1;b、 DNA与连接分子L-0反应，分离、纯化，得到L-2;c、 L-G-1与L-2反应，分尚、纯化，得到L-G-2;d、 L-G_2脱去保护基团，得到L-G-2-1; e、 采用方法1、方法2、方法3、方法4或者其任意的组合： 方法1: L-G-2-1与R1反应，分离、纯化，得到L-G-2-1-1;对L-G-2-1-1进行DNA编码，得到L-G-3-I; 或者；方法2: i、 L-G-2-1与骨架分子反应，分离、纯化，得到L-G-2-2;ii、 L-G_2_2或L-G-2-2脱去保护基团后，与R1反应，分尚、纯化，得到L-G-2-2-1;对L-G-2-2-1进行DNA编码，得到L-G-3-1;或者； 方法3: i、 L-G-2-1与骨架分子反应，分离、纯化，得到L-G-2-2; ii、 L-G_2_2或L-G-2-2脱去保护基团后，与R1反应，分尚、纯化，得到L-G-2-2-1;对L-G- 2- 2-1进行DNA编码，得到L-G-3-1; iii、 L-G_3_1或L-G-3-1脱去保护基团后，与R2反应，分尚、纯化，得到L-G-3-1-1;对L-G- 3- 1-1进彳丁 DNA编码，得到L-GH; 或者；方法4: i、L-G-2-1与骨架分子反应，分尚、纯化，得到L-G-2-2;对L-G-2-2进行DNA编码，得到L-G_3 _l； ;[;[、1^-6-3-1或1^-6-3-1脱去保护基团后，与1?2反应，分尚、纯化，得到1^-6-3-1-1;对1^-6- 3-1-1进彳丁 DNA编码，得到L-GH; 其中，R1、!?2为合成砌块； f、切除L-G-3-I、L-G-3-l和/或L-G-3-2的固相载体，得到L-D-T，即为DNA编码的化合物 库。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a中，所述固相载体选自PEG树脂、PEGA 树脂、无机物固相载体、PE薄片中的任意一种或多种。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a中，所述固相载体选自带有氨基活性 官能团的固相载体;优选的，所述固相载体为4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a中，所述连接分子L-1选自含有酯基、 脂基、硫醋基、邻硝基苄基、香素基团、芳香甲酬基团、置氣、羟基、疏基、疏酿基、駿基、酉全 基、氨基、胺基、酰胺基、烯基、炔基中任意一种或多种官能团的化合物;优选的，所述连接分5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a中，固相载体G-1与连接分子L-1的重 量比为1:0.08~0.2;优选的，固相载体G-1与连接分子L-1的重量比为1:0.138。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a中，反应溶剂为卤烃类溶剂;优选的， 反应溶剂为二氯甲烷。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a中，反应温度为15~25°C;反应时间 为12~16小时。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，分离、纯化的方法为：除去溶剂， 得到固体，固体用DMF和二氯甲烷洗涤，即可。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述L - G - 1为10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤b中，所述DNA为单链DNA。11. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述连接分子L-0选自含有酯 基、脂基、硫醋基、邻硝基苄基、香素基团、芳香甲酬基团、置氣、羟基、疏基、疏酿基、駿基、 醛基、氨基、胺基、酰胺基、烯基、炔基中任意一种或多种官能团的化合物;优选的，所述连接12. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤b中，反应是在缩合剂的条件下进行。13. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于:步骤b中，所述缩合剂为2-氯_4,6_二甲 氧基_1，3,5_三嗪。14. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤b中，DNA与连接分子L-0的摩尔比为 1:50~300，连接分子L-0与缩合剂的摩尔比为1:1~2;优选的，DNA与连接分子L-0的摩尔比 为1:100，连接分子L-0与缩合剂的摩尔比为1:1。15. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤b中，反应温度为15~25°C;反应时间 为12~16小时。16. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤b中，分离、纯化的方法为:调节pH=4 ~5，加入乙醇，于-20 °C下沉淀后，离心，得到固体，洗涤，即可。17. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述L - 2为18. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤c中，反应是在有机溶剂的条件下进 行;优选的，反应是在吡啶的条件下进行。19. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，L-G-1与L-2的摩尔比为2~10: 1，L-G-1与吡啶的重量体积比为1:0.8~2.5mg/yL;优选的，L-G-1与L-2的摩尔比为5:1，L-G-1与吡啶的重量体积比为1: lmg/yL。20. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤c中，反应温度为20~45°C;反应时间 为14~30小时;优选的，反应温度为40°C ;反应时间为21h。21. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤c中，分离、纯化的方法为:除去溶剂， 得到固体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涤，即可。22. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述L - G - 2为23. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤d中，所述保护基团为氨基保护基团； 优选的，所述保护基团为芴甲氧羰基。24. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤d中，L-G-2是在哌啶、含氮类溶剂的 条件下脱去保护基团，其中，所述L-G-2与哌啶的摩尔体积比为1:100~1 OOOOmo 1 /L，所述哌 啶与含氮类溶剂的体积比为1~4:5~20。25. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤d中，所述L-G-2-1为26. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于：步骤e中，DNA编码的方法 为:标记序列i串联连接在L-G-2-1-1、L-G-2-2-l、L-G-3-1-l或L-G-2-2的DNA上，标记序列i 特异标记R1，其中，R1为合成砌块，i = 1，2;合成过程中，每加入新的R1，就在DNA或标记序列 (i-1)上串联连接标记序列i，合成结束后，在标记序列i上连接末端序列，即可。27. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e中，所述R\R2分别或 同时选自多官能团化合物，多官能团独立地选自氣基、駿基、酸基、烯基、炔基、卤素、置氣、 羟基、巯基、苯基中的任意两种或两种以上;优选的，所述R 1、!?2分别或同时选自氨基酸、取代 或未取代的羧酸、取代或未取代的胺、取代或未取代的烯烃、取代或未取代的炔烃、取代或 未取代的醛、异氰酸酯;更优选的，所述R 1、!?2分别或同时选自异氰酸酯、苄醇或苯甲酸。28. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于：步骤e中，所述骨架分子含 有羟基、氨基、羧基、氰基、醛基中的任意一种或两种以上。29. 根据权利要求28所述的方法，其特征在于:步骤e中，所述骨架分子选自对羟基苯丙 酸、对氨基苯甲酸、对羟基苯甘氨酸、N-芴甲氧羰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸、叔丁基异腈、环己烷基异腈、3-甲基丁醛、环戊烷基醛、 中的任意一种或两种以 上。30. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法1中，反应是在 有机胺和有机溶剂的条件下进行;优选的，反应是在三乙胺和N，N-二甲基甲酰胺的条件下 进行。31. 根据权利要求30所述的方法，其特征在于:步骤e的方法1中，L-G-2-1 j1、有机胺的 摩尔比为1:50~500:50~500儿-6-2-1与有机溶剂的摩尔体积比为1 :50~500腦〇1/此;优 选的，L-G-2-UR1、有机胺的摩尔比为1:150:150，L-G-2-l与有机溶剂的摩尔体积比为1: 240nmol/iiL 〇32. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法1中，反应温度 为25°C~30°C，反应时间为12h~16h。33. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法1中，分离、纯 化的方法为:除去溶剂，得到固体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涤，即可。34. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法2或方法3中， 步骤i的反应是在缩合剂、有机胺和有机溶剂的条件下进行;步骤e的方法4中，步骤i的反应 是在有机溶剂的条件下进行;优选的，反应是在2-(7_偶氮苯并三氮唑)-^^『少'-四甲基 脲六氟磷酸酯、N，N-二异丙基乙胺和含氮类溶剂的条件下进行； 所述L-G-2-1、骨架分子、缩合剂与有机胺的摩尔比为1:50~500:50~500:50~500;所 述化合物L-G-2-1与含氮类溶剂的摩尔体积比为50~500nmol/yL。35. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法2或方法3或方 法4中，步骤i的反应温度为25°C~30°C ;反应时间为12h~16h。36. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法2或方法3或方 法4中，步骤i分离、纯化的方法为:除去溶剂，得到固体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涤，即 可。37. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法2或方法3或方 法4中，步骤ii的反应是在有机胺或有机膦和有机溶剂的条件下进行;优选的，所述有机胺 选自N，N-二异丙基乙胺或三乙胺;所述有机膦选自三苯基膦;所述有机溶剂选自卤烃类溶 剂、醚类溶剂或含氮类溶剂;优选的，所述醚类溶剂选自四氢呋喃;所述含氮类溶剂选自N， N-二甲基甲酰胺。38. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法2或方法3或方 法4中，步骤ii的反应温度为25°C~30°C ;反应时间为12h~16h。39. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法2或方法3或方 法4中，步骤ii分离、纯化的方法为:除去溶剂，得到固体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涤，即 可。40. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法2、方法3或方 法4中，L-G-2-2或L-G-3-1脱去保护基团的方法为:L-G-2-2或L-G-3-1中加入哌啶，于25°C ~30 °C搅拌反应2h~6h，除去溶剂，得到固体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涤，即可。41. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法3或方法4中， 与R2反应是在有机胺和有机溶剂的条件下进行;优选的，所述有机胺选自N，N-二异丙基乙 胺或三乙胺，有机溶剂选自卤烃类溶剂。42. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法3或方法4中， 与R2反应的反应温度为25 °C~30 °C，反应时间为12h~16h。43. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e的方法3或方法4中， 步骤iii中分离、纯化的方法为:除去溶剂，得到固体，固体用水和TEAA缓冲溶液洗涤，即可。44. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于:步骤e中，其中，把为可以形成异氰酸酯的基团。45. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于：步骤f中，切除固相载体的 方法为： ① 、取L-G-3-I、L-G_3_1和/或L-G-3-2，加入喊，反应，分尚、纯化，即可； 或者； ② 、取L-G-3-I、L-G-3-1和/或L-G-3-2，加入roS缓冲溶液，光源下进行分解反应，分离、 纯化，即可。46. 根据权利要求45所述的方法，其特征在于:①中，所述碱选自有机碱或无机碱;反应 温度为30~60°C ;反应时间为1~10小时;优选的，所述无机碱为氨水;反应温度为55 °C ;反 应时间为1小时。47. 根据权利要求45所述的方法，其特征在于:②中，光源的波长为365nm;分解反应的 反应温度为25°C~40°C ;反应时间为lh~8h。48. 根据权利要求45所述的方法，其特征在于:①和/或②中，分离、纯化的方法为：用水 和TEAA缓冲溶液洗涤，得到滤液;将滤液浓缩后，加入乙醇，于-20°C下沉淀后，离心，得到固 体，洗涤，即可。49. 根据权利要求1~25任意一项所述的方法，其特征在于：步骤f中，所述L-D-T为其中，P为可以形成异氰酸酯的基团；Ri-a为为正丁基、异丁基、叔丁 基或环己烷基Ai-。为正丙基、异丙基或环戊烷基;Rk为羧酸、醛、异氰酸酯中的任意一种与 氨基反应生成的基团。50. -种DNA编码化合物库，其特征在于:它具有式I所示的通式：其中，R1 '选自氢或合成砌块； E选自胺基、烯基、炔基、醜胺基、脂基、疏酿基或置氣； A选自羟基、疏基；R为氢、Ci~C8烷基、 烯基或与也中的原子成环选自取代或未取代的炔基、氨基、羧基、醛基、叠氮或巯 基；51. 根据权利要求50所述的DNA编码化合物库，其特征在于:所述骨架分子含有羟基、氨 基、羧基、氰基、醛基中的任意一种或两种以上。52. 根据权利要求51所述的DNA编码化合物库，其特征在于:所述骨架分子选自对羟基 苯丙酸、对氨基苯甲酸、对羟基苯甘氨酸、N-芴甲氧羰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸、叔丁基异腈、环己烷基异腈、3-甲基丁醛、环戊烷基醛 中的任意一种或两 种以上。53. 根据权利要求50所述的DNA编码化合物库，其特征在于:A的长度为10个~50个原 子。54. 根据权利要求50的DNA编码化合物库，其特征在于:它包括以下DNA编码化合物库：其中，P为可以形成异氰酸酯的基团；Ri-a为为正丁基、异丁基、叔丁 基或环己烷基Ai-。为正丙基、异丙基或环戊烷基;Rk为任何羧酸、醛、异氰酸酯中的任意一 种与氨基反应生成的基团。
【文档编号】C40B40/06GK106048736SQ201610229301
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年4月13日 公开号201610229301.0, CN 106048736 A, CN 106048736A, CN 201610229301, CN-A-106048736, CN106048736 A, CN106048736A, CN201610229301, CN201610229301.0
【发明人】李进, 万金桥, 刘观赛, 钟丽娜, 陈仰, 王志, 刘欣城, 穆云, 窦登峰
【申请人】成都先导药物开发有限公司