同步检测3种侵染瓜类的rna病毒的引物组、试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明属于农业生物技术领域，本发明公开了一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、试剂盒及其应用。本发明利用专门针对瓜类褪绿黄化病毒(CCYV)、甜瓜坏死斑点病毒(MNSV)、甜瓜黄化斑点病毒(MYSV)等3种病毒的3对特异引物对CCYV?F/CCYV?R、MNSV?F/MNSV?R、MYSV?F/MYSV?R，并结合一步法RT?PCR检测技术，实现了对3种病毒的同时鉴别。应用本发明，在提取样品总RNA后，仅需一次RT?PCR检测即可实现对3种侵染瓜类的RNA病毒的检测，为调查鉴定提供了较为简便的方法。与传统RT?PCR一次仅能检测一种病毒相比，该法既减少了成本又节约了时间，既保证了灵敏性和特异性同时也简化了操作，是一种特异、灵敏、方便且经济有效的检测方法。
【专利说明】
同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物类病毒检测技术领域，尤其设及一种同步检测巧巾侵染瓜类的RNA 病毒的引物组、试剂盒，W及鉴定瓜类稱绿黄化病毒、甜瓜坏死斑点病毒、甜瓜黄化斑点病 毒的引物对或引物组及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 瓜类稱绿黄化病毒（Cu州rbat chlorotic yellows virus,CCYV)属于长线病毒科 (〔1〇3161'〇￥；[1'1(1日6)毛形病毒属（吐；[]1；[￥；[1'113)。基因组由双链1?酷组成（即1?酷1(8607]11：)和 RNA2(8041nt))，W介体烟粉風进行半持久性传播。主要为害西瓜、甜瓜、黄瓜等，W甜瓜大 面积发病最为常见。该病最早于2004年在日本观察到，至2010年其病原才被掲示。在我国， 古勤生等2007年在宁波、上海等地发现。随后在海南、河南、北京和山东等地有报道。2014- 2015年本课题组调查发现，该病在南宁市、北海市部分甜瓜大棚中发病率高达20-70%? 上，危害较重。
[0003] 甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot vi;rus，MNSV)属于甜瓜丛矮病毒科 (Tombusviridae)香石竹斑驳病毒属（Carmovirus)，基因组为正义单链RNA，约4.3kb。甜瓜 坏死斑点病毒主要通过种子、±壤真菌瓜油壶菌(Olpidium radicale)和黄瓜黑头叶甲进 行自然传播，另外也可通过机械接种进行传播，寄主范围限于葫芦科植物西瓜、南瓜、葫芦、 黄瓜、甜瓜等，其中甜瓜为系统侵染寄主。该病最早于日本报道，随后在美国、希腊、瑞典、意 大利和突尼斯等国家出现。我国于2007年在江苏省海口市溫室甜瓜中发现该病，2015年山 东寿光也有报道。2015年本课题组调查发现，该病在广西也有发生。
[0004] 甜瓜黄化斑点病毒（Melon yellow spot virus，MYSV)，属于布尼亚病毒科 (Bunyaviridae)甜瓜斑萎病毒属(Tospovirus)。基因组包括3个单链线性RNA片段即L RNA、 M RNA和S RNA。在植株间主要是通过栋桐劑马（Thri pspalmi Karny)W持久方式传播，也 可通过汁液机械传播。主要为害甜瓜、西瓜、黄瓜和苦瓜等葫芦科作物，该病毒于2000年在 日本首次发现并命名，2008年我国台湾的西瓜发现受到该病毒侵染，2009年在海南省=亚 市大棚甜瓜被发现受到该病毒侵染。随后，广东的西瓜和山东寿光的黄瓜也有报道。2011年 古勤生等调查发现，海南S亚保护地甜瓜上MYSV的发病率为30-100%，造成严重的经济损 失。2014年起，本课题组在南宁市、北海市等地的甜瓜大棚中发现该病，发病后期造成甜瓜 崎形，丧失经济价值，造成严重的经济损失
[0005] 上述3种病毒均属于RNA病毒。而传统的鉴别方法如：生物学接种法、电镜观察法、 血清学检测法、分子生物学方法等方法要么费时费钱，要么需要昂贵的仪器设备，目前，尚 未见到使用RT-PCR-次即可区分运巧巾病毒的方法。
[0006] 本发明提供的3对引物组由发明人自行设计，并完成了多重PCR的体系优化，引物 配比优化等相关工作；多重PCR就是为了减轻工作量，减少耗材的使用等;设计3对引物组， 可W扩增不同大小的目的条带，便于区分各病毒。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种同步检测巧中侵染瓜类的RNA病毒的引物组、 试剂盒及其应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0009] -种同步检测巧中侵染瓜类的RNA病毒的引物组，包括3对特异性引物对，分别是引 物对CCYV-F和CCYV-R、引物对MNSV-F和MNSV-R、引物对MYSV-F和MYSV-R，其分别具有如沈Q ID No. 1至沈Q ID No.6所示的序列。
[0010] -种用于鉴定瓜类稱绿黄化病毒的引物对，包括特异性引物CCYV-F和CCYV-R，它 们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 2的碱基序列。
[0011] -种用于鉴定甜瓜坏死斑点病毒的引物对，包括特异性引物MNSV-F和MNSV-R，它 们分别具有序列表SEQ. ID. No. 3至SEQ. ID. No. 4的碱基序列。
[0012] 一种用于鉴定甜瓜黄化斑点病毒的引物对，包括特异性引物MYSV-F和MYSV-R，它 们分别具有序列表SEQ. ID. No. 5至SEQ. ID. No. 6的碱基序列。
[0013] 一种同步检测巧巾侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、DEPC 水和RNase-free水，其特征在于:所述的PCR试剂中含有3对特异性引物对，分别是引物对 CCYV-F和CCYV-R、引物对MNSV-F和MNSV-R、引物对MYSV-F和MYSV-R，其分别具有如沈Q ID No. 1至沈Q ID No.6所示的序列。
[0014] 作为优选，所述的PCR试剂每管20化，其中2 Xone Step Buffer 10化， PrimeScript one Step En 巧 me Mix 0.如L，引物 CCYV-F/R各 0.化L、MNSV-F/R各0.化L、 MYSV-F/R各0.化L，模板RNA 1.化L及dd出0 6.化L。
[0015] 作为优选，所述的引物CCYV-F/R、MNSV-F/R、MYSV-F/R的使用浓度为1 OiiM。
[0016] 本发明还提供了所述的同步检测巧中侵染瓜类的RNA病毒的引物组、所述的引物对 或所述的同步检测巧巾侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒在鉴别瓜类稱绿黄化病毒、甜瓜坏死斑 点病毒、甜瓜黄化斑点病毒中的应用。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0018] 1.本发明的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的方法是针对目前3种侵染瓜类的 RNA病毒(CCYV、丽SV和MYSV)危害严重却又缺乏快速有效鉴别手段的问题，发明人根据巧中 病毒的基因序列分别优化设计了对应的3对特异引物CCYV-F/CCYV-R、MNSV-F/MNSV-R、 MYSV-F/MYSV-R，并结合RT-PCR检测技术建立的。
[0019] 2.应用本发明的同步检测巧巾侵染瓜类的RNA病毒的方法，在提取样品总RNA后，仅 需一次RT-PCR检测即可实现对巧巾侵染瓜类的RNA病毒的检测，为调查鉴定提供了较为简便 的方法。与传统RT-PCR-次仅能检测一种病毒相比，该法既减少了成本又节约了时间，既保 证了灵敏性和特异性同时也简化了操作，是一种特异、灵敏、方便且经济有效的检测方法。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明所建立的同步检测巧巾侵染瓜类的RNA病毒的特异性实验结果图；
[0021] 其中，M-DM2000标准分子量；1-健康甜瓜植株；2-已知感染瓜类稱绿黄化病毒样 品；3-已知感染甜瓜坏死斑点病毒样品；4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品；5已知感染瓜 类稱绿黄化病毒、甜瓜坏死斑点病毒和甜瓜黄化斑点病毒的样品。
[0022] 图2为应用本发明所建立的同步检测巧巾侵染瓜类的RNA病毒方法的实例结果图；
[0023] 其中，M-DM2000标准分子量；1-健康甜瓜植株；2-已知感染瓜类稱绿黄化病毒样 品；3-已知感染甜瓜坏死斑点病毒样品；4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品；5已知感染瓜 类稱绿黄化病毒、甜瓜坏死斑点病毒的样品；6-已知感染甜瓜坏死斑点病毒、甜瓜黄化斑点 病毒的样品；7-已知感染瓜类稱绿黄化病毒、甜瓜黄化斑点病毒的样品。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。运些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 夕h在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可W对本发明作各种修改，运些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 实施例1:引物设计
[0027] 根据NCBI上已报道的瓜类稱绿黄化病毒（AB523789)、甜瓜坏死斑点病毒 (M29671)、甜瓜黄化斑点病毒(AF076151)来设计并优选而得3组引物对，具体配对如下表1。 [002引表1同步检巧杉种侵染瓜类的RNA病毒的引物组
[0029] LUUW」 头月化WJZ;
[0031] 待测样本包括:1-健康甜瓜植株;2-已知感染瓜类稱绿黄化病毒样品；3-已知感染 甜瓜坏死斑点病毒样品；4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品；5-已知同时感染瓜类稱绿黄 化病毒、甜瓜黄化斑点病毒和甜瓜坏死斑点病毒样品。
[0032] 按下列步骤对各样品分别进行RT-PCR检测。
[0033] (1)提取样品总RNA
[0034] 称取0.1 g待测样本于研鉢中，加入液氮研磨，研磨后迅速转移至装有ImL TR化〇1- A+总RNA提取试剂的1.5mL离屯、管中，剧烈震荡后冰上放置5min，加入20化L氯仿剧烈震荡， 室溫放置3min，12000rpm离屯、lOmin，取40化L上清液至新EP管中，加入24化L异丙醇，颠倒混 匀，室溫放置12000min离屯、lOmin，弃上清，75%乙醇(RNase-Free水配制)清洗两次，通风楓 内惊干，加入50化RNase-Free水溶解沉淀，-80°C保存备用；
[0035] (2)RT-PCR 反应
[0036] 反应体系：RT-PCR混合液20化，其中2Xone Step Buffer lOuUPrimeScript one Step Enzyme Mix 0.祉L，引物CCYV-F/R各0.化UMNSV-F/R各0.化UMYSV-F/R各0.化L(各 引物的使用浓度为1〇咖），模板RNA 1.2化及d地2〇 6.6化；
[0037] 引物序列如下：
[0038] CCYV-F: CGTAAGTGATCGCAATCAA，见沈Q. ID. No. 1;
[0039] CCYV-R:AGTGATCACTTGACCATCTCC，见沈Q. ID.No.2;
[0040] MNSV-F:GGCAACATTTCGTACACTGAGG，见沈Q. ID. No. 3;
[0041 ] MNSV-R: ACCAGCACCAGAATAAGTAGCG，见沈Q. ID. No. 4;
[0042] MYSV-F:GCCTGTTCCATGAATTGCACC，见沈Q. ID.No.5;
[0043] MYSV-R: AGCTTCCATTGGTTGCTGCG，见沈Q. ID. No. 6;
[0044] 扩增程序:5〇1：3〇111111，941：2111111;随后进行3〇-35个循环，每个循环包括941：3〇3， 55°C45s，72°C45s;最后 72°C10min;
[0045] (3)电泳检测
[0046] 取扣L PCR产物经加入1.2%。的gel-red巧光染料的1.2%琼脂糖凝胶在IXTAE电 泳缓冲液和120V电压条件下电泳30-40min，电泳完成后放置于巧光成像系统下观察。
[0047] (4)检测结果
[0048] 结果如图1所示，在仅感染瓜类稱绿黄化病毒的甜瓜样品中可W观察到一条877bp 核酸条带;在仅感染甜瓜坏死斑点病毒的甜瓜样品中可W观察到一条549bp核酸条带;在仅 感染甜瓜黄化斑点病毒的甜瓜样品中可W观察到一条37化P核酸条带；同时感染=种病毒 的样品中可W观察到=条对应大小的核酸条带。
[0049] 实施例3:
[0050] 参照实施例2检测步骤对各样品分别进行RT-PCR检测。
[0051] 待测样本包括:1-健康甜瓜植株;2-已知感染瓜类稱绿黄化病毒样品；3-已知感染 甜瓜坏死斑点病毒样品；4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品；5-已知感染瓜类稱绿黄化病 毒和甜瓜坏死斑点病毒的样品；6-已知感染瓜甜瓜坏死斑点病毒和甜瓜黄化斑点病毒的样 品；7-已知感染瓜类稱绿黄化病毒和甜瓜黄化斑点病毒的样品。
[0052] 检测结果如图2所示，在仅感染瓜类稱绿黄化病毒的甜瓜样品中可W观察到一条 877bp核酸条带；在仅感染甜瓜坏死斑点病毒的甜瓜样品中可W观察到一条549bp核酸条 带;在仅感染甜瓜黄化斑点病毒的甜瓜样品中可W观察到一条370bp核酸条带；同时感染W 上任意两种病毒的样品中可W观察到两条对应大小的核酸条带。
[0053] 综上所述，应用本发明的同步检测巧中侵染瓜类的RNA病毒的引物组、试剂盒，在提 取样品总RNA后，仅需一次RT-PCR检测即可实现对巧巾侵染瓜类的RNA病毒的检测，为调查鉴 定提供了较为简便的方法。与传统RT-PCR-次仅能检测一种病毒相比，该法既减少了成本 又节约了时间，既保证了灵敏性和特异性同时也简化了操作，是一种特异、灵敏、方便且经 济有效的检测方法。
【主权项】
1. 一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组，其特征在于：包括3对特异性引物 对，分别是引物对CCYV-F和CCYV-R、引物对MNSV-F和MNSV-R、引物对MYSV-F和MYSV-R，其分 别具有如SEQIDNo.l至SEQIDNo.6所示的序列。2. -种用于鉴定瓜类褪绿黄化病毒的引物对，包括特异性引物CCYV-F和CCYV-R，它们 分别具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 2的碱基序列。3. -种用于鉴定甜瓜坏死斑点病毒的引物对，包括特异性引物MNSV-F和MNSV-R，它们 分别具有序列表SEQ. ID. No. 3至SEQ. ID. No. 4的碱基序列。4. 一种用于鉴定甜瓜黄化斑点病毒的引物对，包括特异性引物MYSV-F和MYSV-R，它们 分别具有序列表SEQ. ID. No. 5至SEQ. ID. No. 6的碱基序列。5. -种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、DEPC水 和RNase-free水，其特征在于：所述的PCR试剂中含有3对特异性引物对，分别是引物对 CCYV-F和CCYV-R、引物对MNSV-F和MNSV-R、引物对MYSV-F和MYSV-R，其分别具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No.6所示的序列。6. 根据权利要求5所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒，其特征在于:所述 的PCR试剂每管20yL，其中2Xone Step Buffer 10yL，PrimeScript one Step Enzyme Mix 0·8yL，引物CCYV-F/R各0· 2yL、MNSV-F/R各0·2yL、MYSV-F/R各0·3yL，模板RNA1 ·2yL和ddH20 6.6uL〇7. 根据权利要求6所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒，其特征在于:所述 的引物CCYV-F/R、MNSV-F/R、MYSV-F/R 的使用浓度为 1 ΟμΜ。8. 根据权利要求1所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、权利要求2-4任一 所述的引物对或权利要求5-7任一所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒在鉴别 瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜坏死斑点病毒、甜瓜黄化斑点病毒中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK106048095SQ201610671047
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月14日 公开号201610671047.X, CN 106048095 A, CN 106048095A, CN 201610671047, CN-A-106048095, CN106048095 A, CN106048095A, CN201610671047, CN201610671047.X
【发明人】李战彪, 谢慧婷, 杨世安, 秦碧霞, 崔丽贤, 苏琴, 蔡健和, 邓铁军
【申请人】广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所