风疹病毒检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种风疹病毒检测并联探针，包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3；还公开了含有上述探针的基因芯片以及该基因芯片的试剂盒；还公开了利用该试剂盒进行风疹病毒检测的方法：使用本发明风疹病毒检测试剂盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染风疹病毒；当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。本发明操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，结果准确可靠。
【专利说明】
风疹病毒检测并联探针、基因巧片、试剂盒与检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，设及一种风疹病毒检测的并联探针、基因忍片、试剂 盒与检测方法。
【背景技术】
[0002] 风疹病毒(Rubella. Virus)属节肢介体病毒中的披盖病毒(togavirus)群，为风疹 的病原病毒。风疹病毒是单正链RNA病毒，是限于人类的病毒。风疹病毒易发生垂直感染，孕 妇妊娠早期初次感染风疹病毒后，病毒可通过胎盘屏障进入胎儿，常可造成流产或死胎，还 可导致胎儿发生先天性风疹综合征，引起胎儿崎形。孕妇感染风疹病毒后，一部分人症状较 轻微，但也有一些孕妇会出现典型症状。怀孕3个月W内的孕妇感染风疹病毒后，风疹病毒 可通过胎盘进入胎儿体内，引起胎儿崎形。而且孕妇感染风疹病毒的时间越早，致崎的可能 性越大。目前检测风疹病毒的方法比较常用的方法是化ISA法，普遍存在敏感性低、特异性 差、存在假阳性的缺点。风疹病毒的感染影响着人口素质，与优生优育有重要关系。
[0003] 生物忍片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术。按照检测对象来分类， 可W分为基因忍片和蛋白质忍片等两大类。相较于蛋白质忍片，基因忍片利用的是核巧酸 链之间的互补作用，特异性强，重现性好。基因忍片指的是将大量(通常每平方厘米点阵密 度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子杂交，通过检测每个探针分子的 杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。采用基因忍片进行检测，其检测通量 大，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等 优点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种特异性好、结果准确、假阳性率低、检测效率高的风疹病 毒检测的并联探针、基因忍片、试剂盒与检测方法。
[0005] 本发明实现其目的的技术方案为：
[0006] -种风疹病毒检测并联探针，包括探针1、2、3,序列分别为SEQ ID NO. 1~3。
[0007] -种风疹病毒检测基因忍片，包括固体相和权利要求1所述的探针组。
[000引作为优选地，所述固相载体为氨基修饰的玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。
[0009] -种风疹病毒检测试剂盒，包括前述的基因忍片。
[0010] 在上述风疹病毒检测试剂盒中，还包括风疹病毒祀基因扩增引物对，引物对序列 如沈Q ID NO.4、5所示。
[0011] 作为优选地，所述引物对的下游引物的5'端含有生物素标记。
[0012] 作为优选地，上述风疹病毒检测试剂盒，还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、亲和 素、洗涂液、TMB显色液。
[001引在上述技术方案中，10化的PCR反应体系包括：50~150ngAiL的扩增模板0.4化， Premix化q化L，浓度为8~12咖的上、下游引物各0.化L。
[0014] -种风疹病毒检测方法，使用前述的风疹病毒检测试剂盒进行检测，当检测对象 的=个探针显示的检测结果一致时可W判断样品是否感染风疹病毒；当检测对象的=个探 针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新 检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。
[0015] 作为优选地，PCR 扩增反应程序为 95。[5111111;95。(：103、55。[303、72。[303、30个循 环；72°C10min。
[0016] 本发明的有益效果是:设计=条高特异性的探针，当3条探针均检测出阳性时才判 断该项指标为阳性，能极大的提高产品的准确性和精确性，减少其它方法容易出现的假阳 性问题;本发明通过PCR技术对病原体基因组进行扩增，检测的特异性高，扩增产物与生物 忍片上的寡核巧酸探针进行杂交，通过生物素标记，显色液进行显色后，可W用普通数码相 机拍照或肉眼直接判读，直观的表现检测结果，检测操作简单、结果易读，满足医院、产前检 测等的现场检测需求，为优生优育及诊断风疹病毒感染提供可靠的实验依据。
【附图说明】
[0017] 图1为检测风疹病毒的基因忍片示意图。
[0018] 图2为待测样品风疹病毒基因扩增后PCR产物电泳条带图；Y-R:风疹病毒；M: lOOOObp marker。
【具体实施方式】
[0019] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0020] 主要试剂及生产者：
[0021] 氨基修饰的玻璃基片（武汉阳达生物科技有限公司），病毒基因组DNA/RNA共提试 剂盒(货号DP438,天根生化科技(北京)有限公司），亲和素(辣根过氧化物酶标记）（碧云天 生物技术研究所），TMB显色液(上海生工生物工程有限公司），Premix Taq(TAKARA公司，日 本）：成分为PrimeSTA畑S DNA Polymerase,dNTP Mixture,PrimeSTARBuffer。
[0022] 引物合成公司为英潍捷基(上海)贸易有限公司。
[0023] 实施例1目的片段引物与探针设计
[0024] 查找NCBI数据库中风疹病毒的基因序列，选择高特异性的基因序列作为祀序列 (ID号为:AY161375.1)，设计引物与探针。祀序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计风 疹病毒祀基因的扩增引物与探针，为了使忍片结果用显色液显色后可直接通过肉眼判读， 在风疹病毒祀基因扩增引物的R引物5'端用生物素进行标记，具体序列如下：
[0025] 风疹病毒(RV)祀序列扩增引物：
[0026] F引物（RV-F):5'-TCCGGGTCAAGTTCCATACA-3'（沈QIDN0.4)，
[0027] 巧|物（尺￥-1〇:5'-61〇1111-60：44〔60：4170：(：押64(：-3'（沈9 10^).5)。
[002引 RV并联探针：
[0029] RV 探针 1:
[0030] 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCGGCGTGTCGTGCAACGT-3，（沈Q ID NO.1)，
[0031] RV 探针 2:
[0032] 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCC-3'（沈Q ID N0.2)，
[0033] RV 探针 3:
[0034] 5 '-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACATTATGAATTACACC-3 '（沈Q ID NO.3)。
[0035] 实施例2忍片的制备
[0036] 将实施例1中RV的并联探针按照表1的顺序点样到氨基修饰的玻璃基片上，得到含 有探针的基因忍片(如图1所示）。探针浓度为30iiM，每个点0.化L，然后80°C解育1.5小时。
[0037] 表1风疹病毒检测忍片探针排列顺序 [omftl
[0039] 实施例3检测方法
[0040] 1、待测样品基因组提取
[0041] 使用病毒基因组DNA/RNA共提试剂盒，按照操作说明书的步骤提取待测样品的基 因组作为扩增模板。
[0042] 2、PCR扩增目的片段
[0043] 经过大量实验摸索，确定RV检测的祀基因 PCR扩增体系和PCR反应程序。
[0044] 总体积为10化的PCR扩增体系含有如下试剂： rnn4si
[0046] PCR 反应程序为：951：5111111;95°(：1〇3、551：3〇3、721：3〇3、30个循环；72°(：1〇111111。
[0047] 3、PCR产物与忍片杂交 [004引按照如下步骤操作：
[0049] a.在实施例2中制备好的基因忍片上，将待测样品的PCR扩增产物点样到3个探针 的检测孔中，具体步骤为:PCR产物95 °C解链5分钟，迅速置于冰上，PCR产物与杂交缓冲液 (50%甲酯胺，10XSSC，0.2%SDS)等体积混合，每孔点10微升混合液，在湿盒中，于60°C杂 交解育2小时。
[0050] b.取出解育后的基因忍片，用洗涂液(0.3 X SSC缓冲液)清洗3次，惊干忍片。
[0051] C.将亲和素(辣根过氧化物酶标记)加到惊干的忍片上，室溫解育lOmin。
[0052] d.用洗涂液(0.3 X SSC缓冲液)清洗3次后惊干；
[0053] e.在惊干的基因忍片上点样TMB显色液，反应15分钟，拍照，统计结果，检测对象为 阳性的样品TMB显色反应后溶液颜色由蓝色变为黄色。
[0054] 实施例4检测待测样品
[0055] 从第=军医大学获取感染了风疹病毒的样本20份（阴道分泌物），按照实施例1和3 中的引物和方法分别提取待测样品的基因组，进行PCR扩增后，使用实施例2中的基因忍片 进行检测。PCR扩增后的产物电泳条带表明本发明设计的风疹病毒祀序列扩增引物特异性 高，能特异、灵敏地扩增出目标基因（如图2所示）。
[0056] 对于感染了风疹病毒的样品，TMB显色反应后溶液颜色由蓝色变为黄色，表明样品 为阳性，感染了该病原体，检测中设置阳性和阴性对照。判断检测结果时，当=个探针均显 示阳性时才判断该样品感染了病原体，如果其中某一个或者两个探针显示阴性，则应对该 检测样品重新检测，=个探针结果须一致才能采信该检测结果。=个探针检测结果不一致 时，也可使用现有其它技术(比如Elisa方法)进一步检测验证。
[0057] 使用本发明方法检测20份已知阳性样品，结果显示，19份样品的3个探针均显示阳 性，即感染了风疹病毒，与实际情况吻合;而另1份样品的2个探针显示阳性、1个探针显示阴 性，对该可疑样品用本发明试剂盒重新检测，结果仍为2个探针显示阳性、1个探针显示阴 性，采取E1 i sa方法检测，E1 i sa检测为阳性。
[0058] 本发明的探针、基因忍片、试剂盒，特异性高、结果非常准确，检测快速、工作效率 高，操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，为优生优育及诊断风疹病 毒感染提供可靠的实验依据。
【主权项】
1. 一种风疹病毒检测并联探针，其特征在于:包括探针1、2、3,序列分别为SEQ ID NO.1 ~3〇2. -种风疹病毒检测基因芯片，其特征在于:包括固体相和权利要求1所述的探针组。3. 如权利要求2所述的风疹病毒检测基因芯片，其特征在于:所述固相载体为氨基修饰 的玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。4. 一种风疹病毒检测试剂盒，其特征在于:包括权利要求2或3所述的基因芯片。5. 如权利要求4所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于:还包括风疹病毒靶基因扩增 引物对，引物对序列如SEQ ID N0.4、5所示。6. 如权利要求5所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于:所述引物对的下游引物的5' 端含有生物素标记。7. 如权利要求6所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于:还包括PCR反应体系、杂交缓 冲液、亲和素、洗涤液、TMB显色液。8. 如权利要求7所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于：10yL的PCR反应体系包括:50 ~150ng/yL的扩增模板0 · 4yL，Premix Taq 5yL，浓度为8~12μΜ的上、下游引物各0 · 2yL。9. 一种风疹病毒检测方法，其特征在于:使用权利要求4至8任一项所述的风疹病毒检 测试剂盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染 风疹病毒；当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性 或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。10. 如权利要求9所述的风疹病毒检测方法，其特征在于：PCR扩增反应程序为95°C 511^11;95。(：1〇8、551€3〇8、721€3〇8、30个循环 ；72。(：1〇11^11。
【文档编号】C12Q1/68GK106048086SQ201610401891
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】周勇, 徐建
【申请人】重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司