一种hpv分型检测引物及其检测方法和应用

一种hpv分型检测引物及其检测方法和应用
【专利摘要】本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种HPV分型检测引物及其检测方法和应用。分型检测HPV的qPCR引分别由SEQ ID NO:1?38所示，所述分型检测HPV的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中的应用。本发明提供的引物对以及试剂盒在HPV检测分型特异性、灵敏度都远高于常见的反向点杂交方法，且对环境和操作要求较低，应用广泛。同时本发明还将DNA双链嵌合荧光染料qPCR检测方法应用到HPV分型检测中，并通过扩增曲线及熔解曲线双重分析提高检测特异性，在特异性达到探针法检测水平的同时，极大地降低了成本，对HPV普查的推广和宫颈癌的防治具有重要意义，具有极高的推广应用价值。
【专利说明】
-种HPV分型检测引物及其检测方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物检测技术领域，具体设及一种HPV分型检测引物及其检测方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 人乳头状瘤病毒化uman化pilloma Virus，HPV)属于乳头瘤病毒属，是一种特异 性感染皮肤或粘膜复层上皮的病毒。HPV是一种双链DNA病毒，基因组大小约为7900对碱基。 基因组编码3个功能区，即早期转录区化arly Region，E区）、晚期转录区化ate Region，L 区）和上游调控区化CR)dE区按顺序为66、67、61、62、63、64和65共7个基因，具有参与病毒 DNA的复制、转录、翻译、调控和细胞转化等功能。L区主要有衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2， 其功能是编码病毒的衣壳蛋白。LCR含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV基因表达所必需的 调控元件，调控病毒的转录与复制。
[0003] 目前已经确定的HPV类型超过120种，在临床上根据其致癌的风险不同分为高危型 和低危型。低危型与性传播痛或尖锐湿痛有关，一般不诱发癌变，常见的低危型为6、11、44、 81等;高危型的感染则是子宫颈癌及子宫上皮内瘤变发生的必要条件，常见的高危型有16、 18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 等。另外，有研究显示，除了 16 和 18 运两种 最常见的高危型之外，其它各种类型的HPV具有明显的地域性差异。非洲较为流行的是 HPV45和HPV33，欧洲较为流行的HPV45，南、北美洲是HPV31、33和45。而我国较流行的是58， 5 巧 P81。
[0004] 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，全世界每年宫颈癌的新发病例大约 500000,是除乳腺癌之外威胁女性生命健康的第二大恶性肿瘤。导致宫颈癌的发病的因素 很多，但其中99.7%都与高危型HPV的反复感染有关。因此，HPV普查对于宫颈癌的预防，早 期发现及治疗都具有重要的意义。现如今，针对我国宫颈癌高发的实际情况，针对中国育龄 妇女人数多、缺乏对HPV感染与宫颈癌发生发展关系认识的现状，专家呼吁，应从源头抓起， 由政府牵头尽快完善HPV普查、宫颈癌早诊早治的预防模式。目前，政府虽已在努力开展宫 颈癌筛查，但受经费和技术条件限制，每年受益人群有限，相对于中国妇女的庞大基数而 言，可谓杯水车薪。
[0005] 由于HPV至今尚不能在体外培养，又无合适的实验动物，因而对其检测主要依赖于 形态学鉴定和分子生物学检测技术。目前已经在临床中应用的HPV检测方法主要包括如下 几大类:细胞病理学检查，组织学检查，免疫学检查和分子生物学检查等。
[0006] 细胞学检查包括传统己氏涂片(CV)、液基薄层细胞学技术(TCT)、自动细胞学检测 系统(CT)等。该方法优点:操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查;缺点：凹空细胞是HPV感染 的主要形态学改变，但由于其他病毒感染及人为因素均有可能造成细胞内出现空泡或凹空 样变，而且细胞学检查易受取材、染色及细胞病理医生的主观判断等因素的影响，因此应用 细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高、不能对HPV进行分 型。
[0007]组织学检查包括肉眼观察；阴道镜观察;组织检查。该方法优点:操作简单，价格低 廉，适宜作初步筛查;缺点：准确率低，人员素质要求高，病人痛苦程度大，屯、里抵触不愿意 配合检查。
[000引免疫组化检查包括化ISA，免疫沉淀法等。该方法优点：原理明确，操作相对简单； 缺点:血清学检测的对象是抗原和抗体，由于人体对HPV产生免疫应答有一定的迟滞性，所 W血清学检测对无免疫应答者和HPV潜伏期感染者会产生漏检。
[0009] 随着分子生物学技术的发展，通过检测HPV-DNA的方法来鉴别HPV感染类型在临床 上的应用越来越广泛。具体可W分为=类：
[0010] 第一类是直接探针结合法，如有HPV类型特异性探针的Southern印迹和点印迹，原 位杂交过滤(FISH)等法，由于其低灵敏度、操作繁琐费时及需要大量纯化的探针，现已很少 义用。
[0011 ]第二类是f目号放大法，如杂义捕获法和bDNA法。杂义捕获化ybrid化pture)法是 美国Digene公司的检测HPV-DNA的技术，是目前获得美国FDA批准可在临床使用的一种检测 HPV-DNA的检测技术，在上述方法中，利用Hybrid Cap化re的液体杂交和普通引物PCR之后 线性探针测试被认为是针对于诊断目的最合适的方法。商业化的Hybrid Cap化re试剂盒无 须PCR扩增即可检出临床样品中的HPV-DNA，并且可区别出高危型和低危型。但是，使用RNA 探针可能会影响试剂盒的稳定性，并且也不能排除交叉反应的可能。
[0012] 第S类方法是基于PCR的祀序列片段扩增技术，应用PCR对特异型HPV祀序列片段 进行扩增，用型特异性的寡核巧酸探针鉴别HPV型别。常见的方法有:Amplicor微孔板检测 法，反向点杂交法等。等运些基于通用引物PCR的方法，都存在几个缺点，一是经过PCR反应 之后，样本需要通过进一步的开盖操作才能完成检测;二是对于多重感染的样本，通用引物 具有一定的偏好性，会选择性的放大优势类型，而劣势类型可能会淹没在背景中。
[0013] 实时巧光定量PCR技术使用的巧光化学方法主要包括双链DNA结合巧光染料发光 法和探针法(如化qMan探针）。双链DNA结合巧光染料发光法主要包括SYBR I染料法和近年 兴起的更为敏感的EvaGreen染料法。虽然成本低廉，但是，双链DNA结合巧光染料发光法具 有一个显著的缺点，即其特异性非常容易受到非特异性基因扩增和引物二聚体形成的影 响，运使得双链DNA结合巧光染料qPCR方法一直无法能够有效地应用于临床检测。探针法 qPCR可W有效地解决双链DNA结合巧光染料qPCR非特异性问题，但其最主要的缺点就是探 针设计成本太高，无法广泛地应用到像HPV感染运类疾病的筛查之中去。因此，改进和完善 成本非常低的双链DNA巧光染料结合定量PCR方法对于许多需要在大众人群中广泛普查的 疾病和传染性疾病，尤其是HPV的普查和宫颈癌的防治具有重大意义，对于分子诊断能尽早 地应用于广大基层医院也有重要的现实意义。

【发明内容】

[0014] 本发明目的在于提供一种HPV分型检测引物及其检测方法和应用。
[0015] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0016] 一种分型检测HPV的qPCR引物：
[0017] 特异性的扩增高危型HPV16的引物对为沈Q ID NO: 1-2所示；
[001引特异性的扩增高危型HPV18的引物对为SEQ ID NO:3-4所示；
[0019] 特异性的扩增高危型HPV31的引物对为沈Q ID NO:5-6所示；
[0020] 特异性的扩增高危型HPV33的引物对为SEQ ID NO:7-8所示；
[0021] 特异性的扩增高危型HPV35的引物对为SEQ ID NO:9-10所示；
[0022] 特异性的扩增高危型HPV39的引物对为SEQ ID NO:11-12所示；
[0023] 特异性的扩增高危型HPV45的引物对为SEQ ID NO:13-14所示；
[0024] 特异性的扩增高危型HPV51的引物对为SEQ ID NO: 15-16所示；
[0025] 特异性的扩增高危型HPV52的引物对为SEQ ID NO:17-18所示；
[0026] 特异性的扩增高危型HPV53的引物对为SEQ ID NO:19-20所示；
[0027] 特异性的扩增高危型HPV56的引物对为SEQ ID NO:21-22所示；
[002引特异性的扩增高危型HPV58的引物对为SEQ ID NO:23-24所示；
[0029] 特异性的扩增高危型HPV59的引物对为SEQ ID NO:25-26所示；
[0030] 特异性的扩增高危型HPV66的引物对为SEQ ID NO:27-28所示；
[0031] 特异性的扩增高危型HPV68的引物对为SEQ ID NO:29-30所示；
[0032] 或与沈Q ID NO:1-30所示序列同源性达70-90%的序列。
[0033] 一种分型检测HPV的qPCR引物：
[0034] 特异性的扩增低危型HPV6的引物对为SEQ ID NO:31-32所示；
[0035] 特异性的扩增低危型HPV11的引物对为SEQ ID NO:33-34所示；
[0036] 特异性的扩增低危型HPV44的引物对为SEQ ID NO:35-36所示；
[0037] 特异性的扩增低危型HPV81的引物对为SEQ ID NO:37-38所示；
[003引或与沈Q ID NO:31-38所示序列同源性达70-90%的序列。
[0039] 一种分型检测册V的qPCR引物的应用，所述分型检测册V的qPCR引物在制备HPV检 测试剂盒中的应用。
[0040] 所述分型检测HPV的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中扩增阳性对照引物对核巧 酸序列如沈Q ID NO :39-40所示。
[0041 ] 一种HPV检测试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO: 1-38所示的特异性扩增HPV的核 巧酸序列，及SEQ ID NO: 39-40所示对照引物对。
[0042]所述试剂盒扩增高危型 HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、 HPV66 或 HPV68;扩增低危型 HPV6、HPV11、HPV44 或 HPV81。
[004引所述试剂盒还包括标准品、qPCR反应混合液UaqTM Universal SYBR GreenSupermix，标准品，超纯水，用于qPCR扩增的八联管及盖子。
[0044] 其中，标准品为含有相应检测HPV亚型目的片段的质粒和背景DNA混合液，上述标 准品由含有目的片段的质粒与背景DNA(不含目的片）按1:300000的质量比混合，含有目的 片段的质粒在标准品中的终浓度未1〇7拷贝/微升。
[0045] 一种HPV检测试剂盒的应用，所述HPV检测试剂盒在检测HPV中的应用。
[0046] 具体，将待检测的样品经所述HPV检测试剂盒进行扩增，将扩增产物在扩增曲线和 烙解曲线的双重数值分析，进而确定待检测的样品的感染类型。
[0047] 所述扩增产物在扩增曲线的ct值，分3种情况：l.ct值小于30,再由烙解曲线的烙 解峰位置进行判定，若烙解峰位置与引物类型的标准峰一致，则为阳性;反之为阴性;2. ct 值大于30小于35,再由烙解曲线的烙解峰位置进行判定，若烙解峰位置与引物类型的标准 峰一致的基础上，峰型为尖锐睹峭，则为阳性，反之则为阴性;3. ct值大于35为阴性。（对于 扩增曲线中ct值35的引物类型，则直接认定为阴性。而当阳性参照的ct值大于35时，说明所 提取的样本DNA不合格或反应过程出现问题，需要重新实验）
[004引本发明所具有优点：
[0049] (1)本发明引物可对各种类型HPV DNA检测特异性强，采用本发明检测分析方法， 解决了DNA结合巧光染料qPCR用于HPV分子诊断时无法区分目的片段与存在的非特异信号 扩增和二聚体形成等问题。
[0050] (2)本发明能够准确地鉴别15种常见高危型和4种常见低危型HPV感染，为临床诊 疗提供可靠指南。
[0051] (3)本发明中的每种特异性引物的反应过程均在独立的反应管中进行，体系配制 完成后就实现全程闭管，及避免了通用引物在多重感染样本检测中的偏好性，也避免了反 复开盖造成的交叉污染。
[0052] (4)本发明将双链DNA结合巧光染料与qPCR检测方法相结合，为HPV防治提供了快 速准确的分子检测手段，同时大大降低了检验成本，本发明检测方法的成本仅为探针法的 20%。
[0053] (5)本发明进行灵敏度检测的标准品是用含有目的片段的质粒与人基因组DNA按 一定比例混合而成的，既可W准确反应体系中的HPV拷贝数，又与实际样本中提到的DNA类 似，可W准确反应本发明的检测灵敏度。而传统测法只用质粒做灵敏度检测标准品，没有将 大量的人基因组对检测效率的影响考虑在内。
[0054] (6)本发明对环境及操作的要求相对常规qPCR较低，在各种常见轻微污染的情况 下，仍然可W准确检测出目标HPV类型。
【附图说明】
[0055] 图1为本发明实施例提供的染料法中使用的DNA双链结合染料SYBR与DNA结合示意 图；
[0056] 图2为本发明实施例提供的16型标准品浓度梯度（ 106-102copies/微升)扩增曲线 (左)及计算得到的标准曲线(右）；
[0057] 图3为本发明实施例提供的18型标准品浓度梯度（107-l〇icopies/微升)扩增曲线 (左)及计算得到的标准曲线(右）；
[005引图4为本发明实施例提供的53型标准品浓度梯度（107-l0icopies/微升)扩增曲线 (左)及计算得到的标准曲线(右）；
[0059] 图5为本发明实施例提供的66型标准品浓度梯度（107-l〇icopies/微升)扩增曲线 (左)及计算得到的标准曲线(右）；
[0060] 图6为本发明实施例提供的44型标准品浓度梯度（107-l〇icopies/微升)扩增曲线 (左)及计算得到的标准曲线(右）；
[0061] 图7为本发明实施例提供的16型标准品烙解峰对应溫度标准曲线；
[0062] 图8为本发明实施例提供的18型标准品烙解峰对应溫度标准曲线；
[0063] 图9为本发明实施例提供的53型标准品烙解峰对应溫度标准曲线；
[0064] 图10为本发明实施例提供的66型标准品烙解峰对应溫度标准曲线；
[0065] 图11为本发明实施例提供的44型标准品烙解峰对应溫度标准曲线；
[0066] 图12为本发明实施例提供的实际检测样品的扩增曲线；
[0067] 图13为本发明实施例提供的实际检测样品的烙解峰曲线；
[0068] 图14为16型特异性引物扩增常见21种单独感染的临床样本的扩增曲线（左）和烙 解曲线(右）；
[0069] 图15为45型特异性引物扩增常见21种单独感染的临床样本的扩增曲线（左）和烙 解曲线(右）；
[0070] 图16为6型特异性引物扩增常见2巧中单独感染的临床样本的扩增曲线(左)和烙解 曲线化）；
[0071] 图17为81型特异性引物扩增常见21种单独感染的临床样本的扩增曲线（左）和烙 解曲线(右）。
[0072] 图18为HPV53型标准品中质粒的测序结果。
【具体实施方式】
[0073] 本发明所提供的引物对W及HPV检测试剂盒，其HPV检测分型特异性、灵敏度都远 高于常见的反向点杂交方法，且对环境和操作要求较低，应用广泛。本发明还将DNA双链嵌 合巧光染料qPCR检测方法应用到HPV分型检测并通过扩增曲线及烙解曲线双重分析提高检 测特异性，在特异性达到探针法检测水平的同时，极大地降低了成本，对HPV普查的推广和 宫颈癌的防治具有重要意义，具有极高的推广应用价值。
[0074] 如下所述仅为本发明【具体实施方式】之一，目的是可W使本发明更容易理解，但本 发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本领域的技术人员在本发明所掲露的技术范围 内，可不经过创造性劳动所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此本 发明的保护范围应该W权利要求书所限定的保护范围为准。
[00巧]实施例1:引物设计。
[0076] 通过NCBI上的primer-blast软件针对不同高危型或低危型册V设计特异性引物， 保证引物对与其它HPV类型及人基因组没有同源性。之后将得到的多对引物(平均10对)输 入〇1 igo 6软件进行分析，综合考虑引物自匹配、颈环结构、扩增效率及错配情况，分别获得 出最优的针对不同高危型或低危型HPV引物对，具体如下
[0077] 高危型HPV16特异性引物其序列如SEQ ID N0:1~2所示：
[007引 SEQ ID NO: 1 (HPV16F): 5' CAGACGACTATCCAGCGACC3' ；
[0079] SEQ ID NO: 2(HPV16R): 5' GCAGTGAGGATTGGAGCACT3' ；
[0080] 高危型HPV18特异性引物其序列如沈Q ID N0:3~4所示：
[0081 ] SEQ ID NO: 3(HPV18F): 5' CTGCTACACGACCTGGACAC3' ；
[0082] SEQ ID NO: 4(HPV18R): 5' CACCGAGAAGTGGGTTGACA3' ；
[0083] 高危型HPV31特异性引物其序列如沈Q ID N0:5~6所示：
[0084] SEQ ID NO: 5(HPV31F): 5' TGCAAAGGTCAGTTAACAGAA3' ；
[0085] 沈Q ID N0:6(HPV31R):5,GTACACACTCCGTGTGGTGT--3，；
[0086] 高危型HPV33特异性引物其序列如SEQ ID N0:7~8所示：
[0087] SEQ ID NO: 7(HPV33F): 5' GCAACAACACGTACCAGCAA3' ；
[008引 SEQ ID NO: 8(HPV33R): 5' CAGGGCCAGACATAACAGGA3' ；
[0089] 高危型HPV35特异性引物其序列如SEQ ID N0:9~10所示：
[0090] SEQ ID NO: 9(HPV35F): 5' AGGTGCGGTATGTTTCAGGA3' ；
[0091] 沈Q ID N0:10(HPV35R):5'GCTTTCTTCTACCTCGTTGCAC--3'；
[0092] 高危型HPV39特异性引物其序列如沈Q ID NO: 11~12所示：
[0093] 沈Q ID NO: 11 (HPV39F): 5' TAATACAAGGGATTCGGGCACT3' ；
[0094] 沈Q ID NO: 12(HPV39R): 5' AGTAGATGCTGAAGAAGCCACA3' ；
[0095] 高危型HPV45特异性引物其序列如SEQ ID NO: 13~14所示：
[0096] SEQ ID NO: 13(HPV45F): 5，AGTGTTGTGTAGGGTTGCAC3，；
[0097] 沈Q ID NO: 14(HPV45R): 5' TGGATGCTGTGTAGTATGCAAG3' ；
[0098] 高危型HPV51特异性引物其序列如沈Q ID NO: 15~16所示：
[0099] 沈Q ID N0:15(HPV51F):5,CATGTACGGGTGTATGTGGGTA3，；
[0100] SEQ ID N0:16(HPV51R):5'AATAGGGACGCCACCGAAAC3'；
[0101] 高危型HPV52特异性引物其序列如SEQ ID NO: 17~18所示：
[0102] SEQ ID N0:17(HPV52F):5'GTCCTTGGCACAGTAACAACT3'；
[0103] 沈Q ID N0:18(HPV52R):5,TGTGAGTCAGCAGGTCAGTTT3，；
[0104] 高危型HPV53特异性引物其序列如SEQ ID NO: 19~20所示：
[0105] 沈Q ID N0:19(HPV53F):5'AGTATGTAAGGGAGGCAAGTG3'；
[0106] 沈Q ID N0:20(HPV53R):5'CACTTCCTGACCCTATGCTC3'；
[0107] 高危型HPV56特异性引物其序列如沈Q ID N0:21~22所示：
[010引 SEQ ID N0:21(HPV56F):5'ATTCCAGGCTTTAGGCGTA3'；
[0109] 沈Q ID N0:22(HPV56R):5'GCAGATACTAATGTTGCAGGTC3'；
[0110] 高危型HPV58特异性引物其序列如沈Q ID N0:23~24所示：
[0111] 沈Q ID NO: 23(HPV58F): 5，ATGTGTGTGTATCGTGGAAA3，；
[0112] 沈Q ID NO: 24(HPV58R): 5' CGCTGTCTTCTAGCTCAATA3' ；
[0113] 高危型HPV59特异性引物其序列如沈Q ID N0:25~26所示：
[0114] 沈Q ID N0:25(HPV59F):5,CCACAGCGTCACAACATTGT3，；
[0115] SEQ ID N0:26(HPV59R):5'AGGCTCGCAATCCGTCTT3'；
[0116] 高危型HPV66特异性引物其序列如沈Q ID N0:27~28所示：
[0117] 沈Q ID N0:27(HPV66F):5'TCCTCCAGAGAGTCCTACGC3'；
[0118] 沈Q ID NO: 28(HPV66R): 5' CCACAGTGGTTGTGTGTGTTG3' ；
[0119] 高危型HPV69特异性引物其序列如沈Q ID N0:29~30所示：
[0120] 沈Q ID NO: 29(HPV68F): 5' CTTCAGTGGCGTCTACAGCA3' ；
[0121 ]沈Q ID NO: 30(HPV68R): 5' TTACAGGCGTGTTCCAAGCA3' ；
[0122] 低危型HPV6特异性引物其序列如SEQ ID N0:31~32所示：
[0123] 沈Q ID NO: 31 (HPV6F): 5' CCATTGTCACTTCCTAATGACCTG3' ；
[0124] 沈Q ID NO: 32(HPV6R): 5' GGTGTTCCCATAGGTGCAGT3' ；
[0125] 低危型HPVll特异性引物其序列如SEQ ID N0:33~34所示：
[01 %] SEQ ID NO: 33(HPV1 IF): 5，CCACCTGACACTGGGAAGTC3，；
[0127] SEQ ID NO: 34(HPV1 IR): 5' TTGCATCCGTTAGTGGCTGT3' ；
[012引低危型HPV44特异性引物其序列如SEQ ID N0:35~36所示：
[01 巧]SEQ ID NO: 35(HPV44F): 5，GCAGGGCCACAATAATGGTA3，；
[0130] 沈Q ID NO: 36(HPV44R): 5' GGACTGTGTAGTGGCAGCAC3' ；
[0131] 低危型HPV81特异性引物其序列如沈Q ID N0:37~38所示：
[0132] 沈Q ID N0:37(HPV81F):5'GCCTTGCACACTTTGTATTTCC--3'；
[0133] SEQ ID N0:38(HPV81R):5'GTCCTGCAACGTTTCGGTTTA3'；
[0134] W人actb基因作为内参基因，通过NCBI上的primer-blast软件针对人ac忧基因设 计特异性引物。之后将得到的多对引物(平均10对)输入oligo 6软件进行分析，综合考虑引 物自匹配、颈环结构、扩增效率及错配情况，获得最优的引物对，其序列如SEQ ID N0:39~ 40所示：
[0135] SEQ ID NO: 39(actbF): 5，GAGGGCATACCCCTCGTAGA3，；
[0136] SEQ ID N0:40(actbR):5'GTGCTATCCCTGTACGCCTC3'；
[0137] 实施例2:质粒标准品的构建及标准曲线的制定。
[0138] 为了检验所设计的引物是否能够准确地应用于HPV的qPCR分型检测，现相应获得 各种引物的扩增标准曲线。
[0139] W获得HPV53的标准曲线为例：
[0140] -、53型质粒标准品构建：
[0141] (1)目的片段扩增，使用53型目的片段扩增引物(上游:5-GGTATCCGTATGGAGTGTG- 3;下游：5-CCACCTTGCTACATACATGC-3)，WHPV53型感染的临床样本DM为模板。使用K0D- Plus-Neo (T0Y0B0)试剂盒，进行扩增，反应体系和反应条件见表1，2。
[0142] 表1质粒构建目的片段扩增体系
[0143] 0144 0145 0146 0147 *
[0144]
[0145]
[0146] (2)目的片段胶回收及纯化，取50化上述PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，切取 1970bp处的条带即目的片段。利用切胶回收试剂盒回收(AXYGEN，USA Code:AP-GX-50)，按 照其说明书所描述的过程回收并纯化DM片段。 (3)目的片段与载体连接，使用快速DNA连接试剂盒健云天，中国）。连接体系为10 微升：50ng经EcoRWl'hermo)酶切的pUC19，150ng上述PCR产物，0.5微升Rapid T4 DNA ligase，5微升快速连接缓冲液(2X)，无菌双蒸水补至10微升。连接条件为:25°C连接30min。
[0148] (4)转化宿主大肠杆菌，具体步骤如下：（a)待连接反应结束后，全量(10微升)连接 溶液加入至100微升大肠杆菌感受态菌DH5a，冰中放置30min。（b)42 °C加热120s后，再在冰 中放置3miru(c)加入1毫升LB液体培养基，37°C振荡培养60miru(d)5000巧m离屯、2min，弃去 上清，加入40微升2%X-ga巧日7微升20% IPTG将菌体吹吸混匀涂布在含有Amp+(80ug/ml)的 LB固体培养皿。（e) 37 °C倒置培养过夜（12-16h)，形成单菌落。
[0149] (5)PCR鉴定阳性克隆，用灭菌牙签挑取单个白斑菌落，在含有Amp的LB固体培养基 上留种，并薩入20微升PCR反应液中（含PUC19通用引物M13-47和RVM)，进行扩增结果得到 1970bp片段的为阳性菌落。
[0150] (6)测序检测质粒序列质量，将上述鉴定为阳性的菌落接种于3mL LB(Amp+)培养 液中，在37°C培养10-1化，取ImL菌液送测序公司测序。测序结果为该菌落的质粒中含有 EF546472.1序列中第283至2152位共1970个HPV53的同源序列，命名为祀3F2，将含祀3F2的 菌命名D册a/pE3F2。进一步将该序列与NCBI中的HPV53序列比对同源性，结果如图18所示， 可W看出，该序列与GeneBank中多种HPV53序列具有99%W上的同源性，因此祀3F2质粒可 W作为定量HPV53的标准品。
[0151] 另外，其它亚型的标准品也可参照上述记载的方式，即通过获得各亚型的本文中 设及的各特异性引物目标区域序列，再通过常规克隆手段将其转化至质粒载体即可，对质 粒类型无要求载体中，获得含有不同亚型的标准品；同时，标准品也可采用现有的含有不同 亚型的质粒进行替换，或是按照现有技术制备获得。
[0152] 二、标准曲线和标准烙解峰曲线制备。
[0153] 使用质粒小提试剂盒(AXYGEN，USA)提取并纯化上述获得的标准品质粒，而后采用 化no化op超微量分光光度计计算定量拷贝数，梯度稀释成107,106,105,10 4，103，102，1〇1数 量级，同时，在保证质粒拷贝数浓度的前提下，标准品质粒与背景DNA(不含目的片段的DNA 序列，如使用Qiagen DNA mini kit提取自人正常淋己母细胞系HMy2.CIR)按1:300000的质 量比混合。然后^560 10顯：19和560 10^:20序列中记载的引物对进行9口〇?反应，反应 体系和条件按照表3和表4中记载进行配比。
[0154] 由qPCR反应获得产物分别获得HPV53型质粒标准品的扩增标准曲线(参见图4)，和 烙解峰标准曲线(参见图9)。
[01对由图4显示qPCR CT值与册V拷贝数成负相关，随着拷贝数降低，ct值增大。但在有 非特异性扩增的情况下，ct值只能提示扩增结果，而不能在有非特异扩增中进行定量。图9 显示HPV53型的标准烙解峰位置在79. (TC。
[0158] 表4HPV qPCR反应条件(两步法）
[0156] 击9*击>件化純。口耐/水玄 0157
[0159]
[0160] 而后，上述获得的其它亚型的也可按照上述记载的方式，采用实施例1中分别记载 的不同亚型的引物对进行qPCR反应，分别获得各自的标准曲线(参见图2、3、5和6)和标准烙 解峰曲线(参见图7、8、10、11)。
[0161] (此处只是得到上述引物对在扩增对应标准品时得到的标准烙解峰位置对应溫 度，对于在其它一起上使用没有意义，在其他一起上使用前需要使用标准品重新进行矫 正。）由上述附图分别可见特异性引物HPV16，HPV18，HPV66，HPV44对各自目标标准品不同浓 度梯度的扩增效率及目标标准烙解峰的位置分别为:81.5°C，80.5°C，79.5°C，77.0°C。
[0162] 实施例3:引物特异性检测。
[0163] 为了证明各种特异性引物对目标类型的扩增特异性，发明中所有特异性引物均与 常见21种单独HPV感染的临床样本DNA进行扩增，其中各种临床样本均由第S方检测验证感 染类型。且都经过阳性参照扩增保证DNA浓度。
[0164] 现W16型引物为例
[01化]一、2巧巾单独HPV感染的临床样本DNA提取：
[0166] (1)将内含样本的保存管盖梓紧，满旋振荡15秒，使宫颈刷上的脱落细胞尽可能多 的悬浮在保存液中。
[0167] (2)在保存管中吸取1ml保存液于1.5naEP管中，8000g离屯、1分钟，弃上清。
[0168] (3)使用QIAGEN(德国）DNA MINI IQT提取组织的protocol进行DNA提取，最后使用 100微升AE buf f er溶解DNA，即为待测样本DNA溶液。所得到的DNA样本溶液可直接进行后续 qPCR HPV分子检测，也可将其保存在-20°C冻存W备将来检查使用。
[0169] 二、qPCR 反应：
[0170] W上述实施例中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2记载的引物对进行qPCR反应，反应体 系中各组分的添加量如表5所示，然后按表6的反应条件，应用Bio-Rad CFX connect实时定 量PCR系统运行qPCR反应：
[0171] 表5: HPV检测qPCR反应体系
[0172]
[0173] 0174
[0174]
[0175] S、反应结果：
[0176] 由上述扩增产物获得扩增曲线和烙解曲线(参见图14)。在阳性参照actb已经验证 的情况下，首先检查扩增曲线，可见在各种常见类型HPV感染的样本中，只有HPV16+的样本 能在HPV16特异性引物扩增下ct值为22.14，小于30，之后检查烙解曲线，可见HPV16+样本在 HPV16特异性引物的扩增下烙解峰位置为81.5°C，与标准烙解峰一致。判定HPV16特异性引 物可W扩增HPV16+样本。同时，由图可见有部分其它HPV感染类型的ct值在30-35之间，继续 查看它们的烙解峰位置与标准烙解峰不一致，有的甚至没有形成烙解峰，因此判定HPV16特 异性引物不能有效扩增运些HPV感染类型的样本。综上，HPV16引物的特异性较好。
[0177] 而后，按照上述记载的方式分别对45型，6型，81型引物对进行特异性检测，分别获 得各自的扩增曲线和烙解曲线(参见图15，16，17)。
[017引由图15，16，17可见在阳性参照actb已经验证的情况下，首先检查扩增曲线，可见 在各种常见类型HPV感染的样本中，分别只有HPV45+，HPV6+，HPV81+的样本能分别在HPV45， HPV6，HPV81特异性引物扩增下ct值分别为27.81，27.14，26.15，均小于30，之后检查烙解曲 线，可见各样本在HPV45，HPV6，HPV81特异性引物的扩增下烙解峰位置分别为74.8°C，73.0 °C，74.2°C，与标准烙解峰一致。判定HPV45，HPV6，HPV81特异性引物可W特异性扩增对应的 样本。
[0179] 四、检测结果分析方法。
[0180] 待测标本中HPV最终浓度是WqPCR各样本反应结果的CT值来代表的，样本CT值代 表HPV浓度的高低，CT值越高，样本内HPV病毒浓度越低(反之未必）。对于CT值大于35或无扩 增的实验结果，在确认阳性对照actb基因扩增CT值小于35时即可判为HPV阴性;对于CT值小 于30的实验结果，需要进一步结合烙解峰进行分析，如果样本烙解峰与标准烙解峰溫度位 置相同，则为阳性，反之则为阴性。对于扩增曲线中ct在大于30小于35的引物类型，在烙解 峰与标准峰位置相同的基础上，如果满足峰型尖锐睹峭的特点，则为阳性，反之则为阴性。 哪种引物对检测结果为阳性，就提示运种类型的HPV感染。当多组引物对检测结果同时为阳 性时，则提示该样本为多重HPV感染。所有阳性对照actb基因扩增CT值大于35的实验结果应 视为实验程序(样本提取)或操作错误，检测结果判定无效，应重新调整实验程序一直到阳 性对照ac忧基因扩增CT值小于35才能做进一步实验检测判读。
[0181] 实施例4:60例临床患者宫颈刷获取的脱落细胞样本HPV-DNA检测。
[0182] W下结合60例临床患者宫颈脱落细胞样本采用本发明提供的引物进行qPCR HPV 检测；但并不局限于宫颈脱落细胞样本应用，也同样适应于其他各类临床样本HPV分子检 巧。。在本实施例中所使用的60例临床患者样本，42例来自沈阳市妇婴医院，10例来自中国医 科大学第一附属医院，8例来自中国医科大学第四附属医院。
[0183] 1.样本DNA提取及qPCR检测实验。
[0184] 每例临床样本同时检测上述实施例其中记载的20对引物，其中包括阳性参照及19 种HPV引物对。qPCR反应总体系为20微升。所用的样本均保存在宫颈脱落细胞保存管中，并 已经过现阶段各医院常用的反向点杂交法检测HPV感染类型，-80摄氏度保存。
[01化]2. W18号临床样本为例，
[0186] 样品DNA提取：
[0187] (1)将内含样本的保存管盖梓紧，满旋振荡15秒，使宫颈刷上的脱落细胞尽可能多 的悬浮在保存液中。
[0188] (2)在保存管中吸取1ml保存液于1.5naEP管中，8000g离屯、1分钟，弃上清。
[0189] (3)使用QIAGEN(德国）DNA MINI IQT提取组织的protocol进行DNA提取，最后使用 100微升AE buf f er溶解DNA，即为待测样本DNA溶液。所得到的DNA样本溶液可直接进行后续 qPCR HPV分子检测，也可将其保存在-20°C冻存W备将来检查使用。然而，由于临床采样操 作人员同样存在操作手法不同的情况，且患者的实际情况也有较大随机性，因此并不能保 证按所述方法在每个样品中都能提取到合格的DNA，因此每个样本的阳性参照具有重要意 义。
[0190] qPCR反应:同实施例3中qPCR反应。
[0191] 所有qPCR反应体系中各组分的添加量如表7所示，然后按表8的反应条件，应用 Bio-Rad CFX connect实时定量PCR系统运行qPCR反应：
[0192] 表7: HPV检测qPCR反应体系
3.反应结果：
[0193]
[0194]
[0195] 0196 0197 由上述扩增产物获得反应的扩增曲线和烙解曲线(参见图12,13)。按照说明中提 到的双重分析方法，首先检查阳性参照(Actb)的ct值，为20.13,小于30,说明样本DNA提取 及反应过程正常。之后查看各种特异性引物的扩增曲线，发现HPV6特异性引物的ct值为 20.05，然后查看其烙解峰位置与标准烙解峰一致(74.5°C )，则判定该样本HPV6阳性。同时， 我们还看到有部分引物的ct值在30-35之间，继续查看它们的烙解峰位置与标准烙解峰不 一致，有的甚至没有形成烙解峰，因此判定运些类型的HPV为阴性。综上，由上述记载的方式 判定该样本为HPV6单一感染。
[019引而后参照上述记载的方式分别对上述60例临床患者宫颈脱落细胞样本册V qPCR 检测结果统计，样本DNA浓度及质量检测:依据阳性对照actb基因的qPCR测试结果判断原始 样本DNA的提取质量和相对浓度是否可靠 W及实验操作是否正确。60例临床样本actb基因 阳性对照检测结果显示有59例样本ac忧基因扩增CT值均小于30(38号CT值大于30)，烙解曲 线分析为单一峰值，证明样本DNA提取质量和实验操作正确，检测结果可W得到正确判读 (表 9)。
[0199]表9:60例临床患者宫颈脱落细胞样本HPV qPCR检测结果
[0201]
[〇2〇^ 60例病人样本HPV检测结果分析:60例临床患者样本中，除1例DNA提取不和格外， 其余59例检测结果均可正确判读。经统计，共检测出16型阳性样品12例；18型阳性样品10 例;31型阳性样品1例；33型阳性样品1例;35型阳性样品2例；39型阳性样品3例;45型阳性样 品2例；51型阳性样品2例；52型阳性样品9例；53型阳性样品6例；56型阳性样品1例；58型阳 性样品5例;59型阳性样品1例;66型阳性样品3例;68型阳性样品2例;6型阳性样品5例；11型 阳性样品4例;44型阳性样品3例;81型阳性样品5例；阴性样本2例。运与文献中报道的我国 HPV主要感染类型为16、18、52、58型相符。其中检测出了12例复合感染，占总检测数(59例） 的20.3%，提示复合感染在HPV感染中十分常见，并且会出现高危低危型混合感染的情况。 通过对相同样品进行的反向点杂交法检测得到的数据进行对比，一致性仅为81.67%。对于 两种检测方法有分歧的11例样本，我们又采取了第=方检测，使用的是上海之江生物科技 股份有限公司出品的基于化q-man技术的HPV检测试剂盒。其结果显示，所有11例有分歧样 本与本发明的检测结果完全一致。运11例有分歧的样本中，反向点杂交法检测有9例假阴 性，说明其方法检测灵敏度不够;有2例假阳性，说明其方法存在一定的错误性。另一方面， 假阴性多出现在多重感染样本中，说明其方法对多重感染的样本检测存在一定的偏好性， 从而影响试验结果。
【主权项】
1. 一种分型检测HPV的qPCR引物，其特征在于： 特异性的扩增高危型HPV16的引物对为SEQ ID NO: 1-2所示； 特异性的扩增高危型HPV18的引物对为SEQ ID NO :3-4所示； 特异性的扩增高危型HPV31的引物对为SEQ ID N0:5-6所示； 特异性的扩增高危型HPV33的引物对为SEQ ID NO :7-8所示； 特异性的扩增高危型HPV35的引物对为SEQ ID NO :9-10所示； 特异性的扩增高危型HPV39的引物对为SEQ ID NO: 11-12所示； 特异性的扩增高危型HPV45的引物对为SEQ ID NO: 13-14所示； 特异性的扩增高危型HPV51的引物对为SEQ ID NO: 15-16所示； 特异性的扩增高危型HPV52的引物对为SEQ ID NO: 17-18所示； 特异性的扩增高危型HPV53的引物对为SEQ ID NO: 19-20所示； 特异性的扩增高危型HPV56的引物对为SEQ ID N0:21-22所示； 特异性的扩增高危型HPV58的引物对为SEQ ID NO :23-24所示； 特异性的扩增高危型HPV59的引物对为SEQ ID NO :25-26所示； 特异性的扩增高危型HPV66的引物对为SEQ ID NO :27-28所示； 特异性的扩增高危型HPV68的引物对为SEQ ID NO :29-30所示； 或与SEQ ID NO: 1-30所示序列同源性达70-90%的序列。2. -种分型检测HPV的qPCR引物，其特征在于： 特异性的扩增低危型HPV6的引物对为SEQ ID N0:31-32所示； 特异性的扩增低危型HPV11的引物对为SEQ ID NO :33-34所示； 特异性的扩增低危型HPV44的引物对为SEQ ID NO :35-36所示； 特异性的扩增低危型HPV81的引物对为SEQ ID NO :37-38所示； 或与SEQ ID N0:31-38所示序列同源性达70-90%的序列。3. -种权利要求1或2所述的分型检测HPV的qPCR引物的应用，其特征在于:所述分型检 测HPV的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中的应用。4. 按权利要求3所述的分型检测HPV的qPCR引物的应用，其特征在于:所述分型检测HPV 的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中扩增阳性对照引物对核苷酸序列如SEQ ID NO: 39-40 所示。5. -种HPV检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括SEQ ID NO: 1-38所示的特异性扩 增HPV的核苷酸序列，及SEQ ID NO: 39-40所示对照引物对。6. 按权利要求5所述的HPV检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒扩增高危型HPV16、 册￥18、册￥35、册￥39、册￥45、册￥51、册￥52、册￥53、册￥66或册￥68;扩增低危型册￥6、册￥11、 HPV44或HPV81。7. -种权利要求5所述的HPV检测试剂盒的应用，其特征在于:所述HPV检测试剂盒在检 测HPV中的应用。8. 按权利要求7所述的HPV检测试剂盒的应用，其特征在于:将待检测的样品经所述HPV 检测试剂盒进行扩增，将扩增产物在扩增曲线和熔解曲线的双重数值分析，进而确定待检 测的样品的感染类型。
【文档编号】C12Q1/68GK106048081SQ201610340555
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】刘博 , 刘一博, 谢静娴, 田柳, 黄妙玲, 于丹
【申请人】胤安国际（辽宁）基因科技股份有限公司