猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的EvaGreen实时荧光定量PCR引物及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的EvaGreen实时荧光定量PCR引物，包括以下引物对：PRRSV?Sense：5?TTTGTGGTGTATCGTGCCGT?3；PRRSV?Antisense：5?GCACAGACTGCGTAAATGCT?3；CSFV?Sense：5?ATAATGGGGCATACCTGCCG?3；CSFV?Antisense：5?TCGGGTAAGGTTGTGATC?3；并提供了利用其检测猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的方法。本发明引物及方法特异、快速、敏感，能同时检测PRRSV、CSFV等RNA病毒。
【专利说明】
猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的EvaGreen实时黄光定量PCR引物 及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子病毒学领域，具体设及一种猪繁殖障碍性疾病RM病毒的 EvaGreen实时巧光定量PCR引物及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 我国是世界养猪第一大国，猪繁殖障碍性疾病一直是养猪业的常见疾病，给猪场 和养猪户造成了严重的经济损失。由于该病病因复杂，一般为多病原的混合感染，临床上较 难控制，治疗效果往往不理想，造成猪群生长缓慢或停滞、病残猪和死亡猪只增多，饲料效 率、生长速度W及猪群整体的均匀度降低，治疗成本增加，影响了猪群的繁殖与改良，威胁 着养猪业尤其是规模化养猪业的发展。猪繁殖障碍性疾病主要是由PRRSV、PCV2、CSFV、PPV、 PRV等的一种或几种病毒的混合感染引起的，因此建立快速有效的检测方法非常有必要。
[0003] 其中PRRSVXSFV病毒为RNA病毒，目前的诊断方法包括近年发展起来的PCR和实时 巧光定量PCR。实时巧光定量PCR有巧光染料和巧光探针之分，巧光探针特异性较好但成本 高，而常用的巧光染料SYBR GreenI因扩增时要求浓度低而导致扩增信号相对较弱，无法解 决由低浓度造成的染料重分布问题，而且低烙点的cDNA链可能由于染料重分布问题而无 法检测到，使其检测的可靠性因此而降低。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明提供一种猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的多重EvaGreen实时 巧光定量PCR引物及其检测方法，该方法特异、快速、敏感，能同时检测PRRSV、CSFV等RNA病 〇
[0005] 为解决W上问题，本发明通过W下技术方案实现： 设计一种猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的EvaGreen实时巧光定量PCR引物，包括W下引物 对(PRRSV、CSFV各自的上下游引物）： PRRSV-Sense:日-TTTGTGGTGTATCGTGCCGT-3 PRRSV-Antisense:日-GCACAGACTGCGTAAATGCT-3 CSFV-Sense:日-ATAATGGGGCATACCTGCCG-3 CSFV-Antisense:5-TCGGGTAAGGTTGTGATC-3。
[0006] 设计一种猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的EvaGreen实时巧光定量PCR检测方法，包括 W下步骤： (1) 别提取PRRSV、CSFV标准品病毒液中的总RNA，将所得总RNA分别按照反转录试剂盒 进行反转录合成cDNA; (2) 取0.5化所得 cDNA，加入10XPCR buffer 5化，2.5mmol/L 的dNTP混合物4 化、 SOpmolAiL的上下游引物各山L、抓/化的化q DNA聚合酶0.扣L，加灭菌双蒸水至反应总体积 50化，混匀后进行PCR扩增；扩增程序为：95°C预变性3 min，94°C 30 s，52°C 30s，72°C 30s，共30个循环，72°C延伸lOmin;PCR反应结束后，取5yL PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检 目的条带，回收目的片段，PRRSV、CSFV的目的条带分别为300、149bp; (3 )将回收的目的片段与P G E M - T E a S y载体连接，构建重组质粒；将重组质粒转化 E.coli JM109感受态细胞，（用质粒提取试剂盒)提取重组质粒，对重组质粒进行PCR鉴定， 获得阳性重组质粒； (4)用紫外分光光度计分别测定阳性重组质粒在26化m和28化m处的吸光度，并计算出 重组质粒的DNA浓度与纯度；将重组质粒进行10倍梯度稀释，制备成1.0X10<^~1.0X 109copies/山的病毒重组质粒作为标准阳性模板； 巧)将PRRSV、CSFV标准阳性模板分别进行巧光定量PCR反应，建立标准曲线，从而可W 得出拷贝数X与Ct值之间的线性关系曲线表达式； 所述巧光定量PCR反应的体系为：标准阳性模板1化，上述4个对应引物各1化，10 X PCR buffer f5]iL，25mmol/L Mg2+4化，2.5mmol/L dNTP 4.化L，10X EvaGreen 扣L，Taq DM Polymerase 2U，加 d加 2〇至反应体系总体积为50化；反应条件为：95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40个循环，烙解曲线程序为:95°C 15s，60 °C 1 min，95°C 15s，60 °C开始 收集巧光信号制作烙解曲线； (6)提取待测样品基因组cDNA，进行巧光定量PCR反应，将所得各目的片段的Ct值代入 标准曲线，即可得到待测样品中各病毒RNA的拷贝数。
[0007] 所述巧光定量PCR反应的体系为:待测样品基因组cDNA模板化L(约10化g)，上述 4个对应引物各化L，10XPCRbuffer扣L，25mmol/LMg2+4化，2.5mmol/LdNTP4.5化，10 X EvaGreen扣LJaq DNA Polymerase 2U，加 d地2〇至反应体系总体积为50化；反应条件 为:95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40个循环，烙解曲线程序为:95°C 15s，60 °C 1 min， 95°C 15s，6(TC开始收集巧光信号制作烙解曲线。
[0008] 本发明具有积极有益的技术效果： (1)标准品cDNA各个稀释度的溶解溫度接近，反应过程中未出现非特异性扩增和明显 引物二聚体，从而说明本发明的引物设计合理，特异性好，抗干扰，反应体系和反应条件得 到了很好的优化。
[0009] (2)本发明在综合考量目标病毒RNA序列的保守区、是否形成二级结构、G+C含量、 碱基随机分布、长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设 计并筛选出了特异性和高灵敏性的检测引物和EvaGreen巧光染料体系，建立的巧光定量 PCR检测体系，特异性强，灵敏度高，且有良好的准确性和重现性。
[0010] (3)本发明筛选使用的新型巧光染料EvaGreen对PCR干扰极小，能够使用高浓度而 使扩增信号强于SYBR Green I、扩增时间比SYBR Green I短，而且高浓度的巧光染料能消 除"染料重分布"的缺陷，具有更高的敏感性和稳定性，因此研究发现EvaGreen更适合于多 重实时巧光PCR。
【具体实施方式】
[0011] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合具体实施例，对本 发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0012] W下实施例中所用试剂及材料来源如下： pGEM-T Easy质粒载体、T4 DNA连接酶均购自Promega公司产品。EX TaqDNA聚合酶为宝 生物工程(大连)有限公司产品。RNA抽提试剂化izol为V-gene公司产品；Eva Green染料为 Biotium公司产品；PTC 200PCR仪，Bio2 Rad实时巧光定量PCR仪。其它未特别说明的试剂、 原料及仪器设备均来源于市售产品。
[0013] 猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪攝病毒(CSFV)及PK-15细胞株均购自中国兽药 监察所。工程菌JM109感受态细胞为宝生物工程(大连)有限公司产品。
[0014] 实施例1 一种PRRSV、CSFV病毒的多重实时巧光定量PCR检测方法，包括W下步骤： 首先，根据PRRSV、CSFV病毒DNA的高度保守区序列、兼顾引物之间兼容性，设计2对特异 引物，设计扩增片段长度分别为300、149bp: PRRSV-Sense:日-TTTGTGGTGTATCGTGCCGT-3 PRRSV-Antisense:日-GCACAGACTGCGTAAATGCT-3 CSFV-Sense:日-ATAATGGGGCATACCTGCCG-3 CSFV-Antisense:5-TCGGGTAAGGTTGTGATC-3; (1) 参照化i zo 1 Reagent试剂盒使用说明书分别提取PRRSV、CSFV标准品病毒液中的总 RNA，将所得总RNA分别按照反转录试剂盒进行反转录合成cDNA; (2) 取0.5化所得 cDNA，加入10XPCR buffer 5化，2.5mmol/L 的dNTP混合物4 化、 SOpmolAiL的上下游引物各山L、抓/化的化q DNA聚合酶0.扣L，加灭菌双蒸水至反应总体积 50化，混匀后进行PCR扩增；扩增程序为：95°C预变性3 min，94°C 30 s，52°C 30s，72°C 30s，共30个循环，72°C延伸lOmin;PCR反应结束后，取5yL PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检 目的条带，回收目的片段，PRRSV、CSFV的目的条带分别为300、149bp; (3 )将回收的目的片段与P G E M - T E a S y载体连接，构建重组质粒；将重组质粒转化 E.coli JM109感受态细胞，（用质粒提取试剂盒)提取重组质粒，对重组质粒进行PCR鉴定， 获得阳性重组质粒； (4)用紫外分光光度计分别测定阳性重组质粒在26化m和28化m处的吸光度，并计算出 重组质粒的DNA浓度与纯度；将重组质粒进行10倍梯度稀释，制备成1.0X10<^~1.0X 109copies/山的病毒重组质粒作为标准阳性模板； 巧)将PRRSV、CSFV标准阳性模板分别进行巧光定量PCR反应，扩增完成后经烙解曲线分 析，扩增产物均能形成特异溶解峰值，其中PRRSV溶解峰值为80.7°C，CSFV溶解峰值为83.6 °C;建立标准曲线，从而可W得出拷贝数X与Ct值之间的线性关系，曲线表达式系统自动分 析软件显示Ct值与标准阳性模板浓度的对数之间存在良好的线性关系。
[001引所述巧光定量PCR反应的体系为：标准阳性模板1化，上述4个引物各liiL，10X PCR buffer f5]iL，25mmol/L Mg2+4化，2.5mmol/L dNTP 4.化L，10X EvaGreen 扣L，Taq DNA Polymerase 2U，加 d加 2〇至反应体系总体积为50化；反应条件为：95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40个循环，烙解曲线程序为:95°C 15s，60 °C 1 min，95°C 15s，60 °C开始 收集巧光信号制作烙解曲线。
[0016] PRRSV的标准曲线的相关系数(R2)为0.9969，斜率为-3.37，截距为40.03，从而可 W得出拷贝数X与Ct值之间的线性关系曲线表达式:Ct = -3.37Xlgx +40.03;CSFV的标准 曲线的相关系数(R2)为0.9989，斜率为-3.35，截距为38.79，从而可W得出拷贝数X与Ct值 之间的线性关系曲线表达式:Ct = -3.35Xlgx +38.79;其中，口1?1?5￥标准品浓度在106~ 50(3〇口163/化内有良好线性关系，扩增效率为0.995(1?2>0.99);〔5。￥标准品浓度在106~ 50 copies/化内有良好线性关系，扩增效率为0.998(R2>0.99)。
[0017] (6)提取待测样品基因组cDNA，进行巧光定量PCR反应，将所得各目的片段的Ct值 代入标准曲线，即可得到待测样品中各病毒RNA的拷贝数。
[0018] 在一个PCR管内内同时加入巧中病毒模板进行EvaGreen多重实时巧光PCR，经扩 增、烙解后得到了2个明显的峰，并经重复试验，最终稳定2种病毒扩增产物的Tm值，其中 PRRSV的Tm值为81.2±0.2°C，CSFV为85.7±0.3°C，不同Tm值间可W直接在烙解曲线上 明显分辨出来。
[0019]特异性试验： 在多重反应体系下加入?〇^2、？?￥、？1?1?5￥、〔5。￥、巧￥、？1?￥和(1地2〇为模板，在相应目的 片段Tm值处PRRSV、CSFV都有特异的目的峰产生，而PCV2、PPV、PRV、JEV及d地2〇的对照组没 有目的峰产生，表明构建的EvaGreen多重实时巧光PCR反应体系特异性较好。
[0020] 灵敏性试验： PRRSV在EvaGreen多重实时巧光PCR体系下灵敏度测定及相应扩增曲线显示PRRSV在浓 度106~lOOcopies/化为模板时烙解曲线均产生明显目的峰，SOcopiesAiL及d地2〇为模 板时没有产生目的峰，表明PRRSV重组质粒的灵敏度可达lOOcopiesAiLsCSFy在EvaGreen 多重实时巧光PCR体系下灵敏度测定及相应扩增曲线，显示CSFV在浓度106~200copiesAi L为模板时烙解曲线均产生明显目的峰，lOOcopies/化及d地20为模板时没有产生目的峰， 表明CSFV重组质粒的灵敏度可达200copiesAiL。
[0021] 稳定及重复性试验： 通过对每种病毒在多重EvaGreen实时巧光PCR后的烙解曲线Tm值进行统计学分析，各 病毒目的片段Tm值批内3次重复性，其中PRRSVXSFV的相应Tm值变异系数分别为0.25% 和0.13%; 3次批间重复性试验PRRSV、CSFV的相应Tm值变异系数分别为0.46%、0.32%，批内批 间变异系数均小于5%，显示EvaGreen多重实时巧光PCR体系稳定性较好。
[0022] 将巧中病毒分别在EvaGreen单重实时巧光PCR中（105、104及10 3copiesAiL)3个浓 度Ct值重复性检测。其中PRRSV批间重复变异系数(Coefficient of variation,CV)分别为 1.22%、2.13%，批内重复中CV分别为1.03%、1.89%; CSFV批间重复中CV分别为0.99%、1.98%， 批内重复中CV分别为0.69%、1.73%。巧中猪病毒的3个浓度梯度在两种重复试验中的变异系 数均小于5%，表明重复性良好。巧中猪病毒在104copiesAiL标准品时，EvaGreen单重巧光PCR 批内3次重复性试验烙解曲线均在各自的溶解溫度附近，显示在同一浓度下烙解曲线具有 较好批内重复性。
[0023] 临床样本检测 将检测样品基因组cDNA各化L(约10化g)加入EvaGreen多重实时巧光PCR反应体系中， 其余组成为：4 个引物各化L，10X PCR buffer 化L，25mmol/L Mg2+4化，2.5mmol/L dNTP 4.f5]iL，10X EvaGreen fSuLJaq DNA Polymerase 2U，加 d地2〇至反应体系总体积为50化； 反应条件为：95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40个循环，烙解曲线程序为：95°C 15s，60 °C 1 min，95°C 15s，60 °C开始收集巧光信号制作烙解曲线。通过制作烙解曲线可W获得 相应扩增产物Tm值。利用本研究建立EvaGreen多重实时巧光PCR方法与普通PCR对60 份血清和60份组织样品分别进行检测(见表1)，其中普通PCR和EvaGreen多重实时巧光 PCR对60份血清样品的检测结果符合率为100%，只检测出CSFV和PRRSV两种猪病毒，CSFV 的阳性率为20.0%，PRRSV的阳性率为23.3%，CSFV与PRRSV混合感染占总样品数10.0%;在对 60份组织样品的检测过程中，EvaGreen多重实时巧光PCR较普通PCR体现了更高的灵敏度， 〔5尸￥通过￡￥曰6'6611多重实时巧光口〇?检出率为25.0%，而普通口〇?中检出率为21.6%，阴性 检测结果两者一致。在血清样品检测中CSFV与PRRSV混合感染占总阳性样品感染率为 50.0%;在组织样品检测中CSFV与PRRSV混合感染占总阳性样品感染率为38.4%，从上述检 测结果可知，无论是在血清样品还是组织样品中，CSFV与PRRSV双重感染比较普遍，同时由 于EvaGreen多重实时巧光PCR具有高于普通PCR的灵敏度，能进一步确保检测结果的可靠 性。
[0024] 表1实时巧光PCR与普通PCR方法检测样品结果
【主权项】
1. 一种猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的EvaGreen实时荧光定量PCR引物，其特征在于，包 括以下引物对： PRRSV-Sense:5-TTTGTGGTGTATCGTGCCGT-3; PRRSV-Antisense:5-GCACAGACTGCGTAAATGCT-3; CSFV-Sense:5-ATAATGGGGCATACCTGCCG-3; CSFV-Antisense:5-TCGGGTAAGGTTGTGATC-3。2. -种猪繁殖障碍性疾病RNA病毒的EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 分别提取PRRSV、CSFV标准品病毒液中的总RNA，再将所得总RNA反转录合成cDNA; (2) 分别取两种所得cDNA进行PCR扩增;PCR反应结束后，取其PCR产物用2%琼脂糖凝胶 电泳检测目的条带，回收目的片段，PRRSV、CSFV的目的条带分别为300、149bp; (3) 将回收的目的片段分别与pGEM-T Easy载体连接，构建重组质粒;将重组质粒转化 E. coli JM109感受态细胞，提取重组质粒，对重组质粒进行PCR鉴定，获得阳性重组质粒； (4) 用紫外分光光度计分别测定阳性重组质粒在260nm和280nm处的吸光度，并计算出 重组质粒的DNA浓度与纯度；将重组质粒进行10倍梯度稀释，制备成1.0X 10°~1.0X 109copiesAiL的病毒重组质粒作为标准阳性模板； (5 )将PRRSV、CSFV标准阳性模板利用权利要求1中所述的引物分别进行荧光定量PCR反 应，建立标准曲线，从而得出拷贝数X与Ct值之间的线性关系曲线表达式； (6)提取待测样品基因组cDNA，利用权利要求1中所述的引物进行焚光定量PCR反应，将 所得各目的片段的Ct值代入标准曲线，即可得到待测样品中各病毒RNA的拷贝数。3. 根据权利要求2所述的EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于:所述琼脂 糖凝胶含有0.5 ug/mL EB。4. 根据权利要求2所述的EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于:所述荧光 定量PCR的反应体系为:基因模板lyL，权利要求1所述引物各1.0yL，10X PCR buffer 5yL， 25mmol/L Mg2+ 4yL,2.5mmol/L dNTP 4.5yL,10X EvaGreen 5yL,Taq DNA Polymerase 2U，加 ddH2〇至反应体系总体积为50yL。5. 根据权利要求2所述的EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于:所述荧光 定量PCR的反应程序为95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40个循环，熔解曲线程序为:95°C 15s，60 °C 1 min，95°C 15s，60°C开始收集荧光信号制作熔解曲线。6. 根据权利要求2所述的EvaGreen实时焚光定量PCR检测方法，其特征在于:在所述步 骤（2)中，PCR扩增方法为：分别取两种所得cDNA 0.5yL，加入10XPCR buffer 5yL、 2.5mmol/L的dNTP混合物4yL、50pmolAxL的上下游引物各lyL、5U/yL的Taq DNA聚合酶0.5μ L，加灭菌双蒸水至反应总体积50yL，混匀后进行PCR扩增;扩增程序为:95°C预变性3 min， 94°C 30 s，52°C 30s，72°C 30s，共30个循环，72°C延伸lOmin。
【文档编号】C12Q1/68GK106048092SQ201610603983
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】赵丽, 何金环, 王瑞宁, 李艳玲, 连瑞丽, 陈忠杰, 卢婷婷, 李存法, 刘永录
【申请人】河南牧业经济学院