一种用于抑制痘病毒感染的制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种用于抑制痘病毒感染的制剂。
【背景技术】
[0002] 痘病毒是一个即可感染人类也可感染动物的庞大家族，常引起感染者局部或全身 化脈性皮肤损害，并可导致传染性疾病暴发。尤其值得注意的是天花病毒，繁殖速度快，而 且可通过空气传播，传播速度极快，携带病毒的患者因其唾液中含有最大量的天花病毒，在 感染后1周内最具传染性，直到病人结瘤剥离后，天花病毒还可通过病人传染，曾导致人类 历史上多次全球性的疫情暴发。在恶性感染情况下，天花病毒在组织层或皮肤深层造成严 重的扩散性破坏，患者体内血液大量流入皮肤、喉魄、肺、肠或子宫，导致无法控制的毒血症 或大出血，运样的患者不会出现典型的丘疹或水瘤状突起，而只是平常的红色或紫色斑痕、 疲点或麻疹样的红斑，一情况下，患者在出现症状后10至14天内死亡，病死率高达25-30%。
[0003] 人类面临病毒性传染病的现实和潜在威胁日益严峻，人类应对突发传染病的防控 压力日感倍增，但愈来愈多的实际情况表明：当病毒发生突变或出现新型病毒而导致传染 病疫情暴发时，原来的特异性防治药物难W发挥应有防控效果，甚至毫无疗效，而人类认知 水平和科研周期的限制，又使具有显著疗效的新一代特异性预防和治疗药物难W在短时间 内推出，极易导致疫情的迅速扩散和局部地区的灾难性暴发，不仅对当地的公共卫生服务 造成极大的破坏，同时也对社会的政治和经济造成巨大的冲击。因此，依据病毒的基本生物 学特性，针对病毒侵染宿主细胞的共性祀点，研发新型病毒感染抑制剂，对于应对病毒性传 染病疫情的持续挑战具有重要意义。
[0004] 植物化合物被称为"第屯类营养素"，广泛存在于日常食物，是一类对人体健康具 有特殊作用的非营养性化学物质。相关研究发现部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物 活性，并逐渐成为抗病毒研究的热点之一。初步的研究结果显示:植物化合物的生物学效应 主要表现在其对细胞膜生物学特性的影响和局部微环境平衡的改变等方面，部分植物化合 物通过直接嵌入细胞膜脂质双层结构，改变细胞膜正常的功能性流动和电势电位差，进而 发挥一定的生物学效应。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抑制痘病毒感染的制剂及其应用。
[0006] 本发明所提供的应用具体为一种制剂在如下（1)或(2)中的应用：
[0007] (1)制备用于抑制痘病毒感染的产品；
[000引（2)用于抑制痘病毒感染；
[0009] 所述制剂主要由表没食子儿茶素没食子酸醋、单宁酸和黄巧多糖混合而成;所述 表没食子儿茶素没食子酸醋、所述单宁酸和所述黄巧多糖的质量配比为(0.5-1.0):(0.5-1.0):(0.5-1.5)。
[0010] 在本发明的一个实施例中，所述用于抑制病毒感染的制剂具体由表没食子儿茶素 没食子酸醋巧GCG)、单宁酸和黄巧多糖混合而成;所述表没食子儿茶素没食子酸醋巧GCG)、 所述单宁酸和所述黄巧多糖的质量配比为1:1:1.5。
[0011] 在本发明中，所述抑制痘病毒感染为如下(a)或(b):
[0012] (a)预防痘病毒感染；
[0013] (b)在与痘病毒同时作用于宿主或宿主细胞时，抑制所述痘病毒对所述宿主或所 述宿主细胞的感染。
[0014] 更加具体的，在本发明的实施例中，所述制剂对所述痘病毒感染的抑制作用具体 体现为：W哺乳动物细胞作为痘病毒感染对象，在痘病毒感染细胞的同时或者在痘病毒感 染细胞前施用所述制剂，所述制剂对痘病毒的半数抑制浓度与抑制病毒感染的阳性对照药 物相比显著降低。所述阳性对照药物具体为利己韦林(Ribavirin)。
[0015] 在本发明中，所述哺乳动物细胞(或(b)中所述的宿主细胞)具体为非洲绿猴肾细 胞(Vero细胞）。
[0016] 在本发明中，所述痘病毒为痘苗病毒。更加具体的，所述痘病毒为痘苗病毒WR株。
[0017] 本发明W痘病毒为实验对象，采用观察细胞病变的方法，在不同的感染条件下，分 别分析了表没食子儿茶素没食子酸醋化GCG)、单宁酸和黄巧多糖运=种植物化合物单体及 其混合制剂抑制病毒感染的规律和特点。结果证实:本发明所提供的=种植物化合物单体 和复合配方混合物的细胞毒性均不高于已经获得安全许可的对照样品利己韦林，较为安 全。在安全的使用浓度下，预防性使用EGCG和单宁酸等植物化合物单体W及植物提取物复 合配方混合物，可W有效的抑制痘病毒的感染。本发明所提供的制剂具有进一步研发为痘 病毒感染抑制剂的商业价值。
【具体实施方式】
[0018] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0019] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0020] 下述实施例中设及的定量实验数据W均数±标准差（±s)表示，采用SPSS 17.0统 计软件运用单因素水平方差分析的方法对组间比较数据进行统计处理。
[0021] 细胞株：非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为ATCC产品，编号为ATCC C化-81。细胞按常 规方法传代培养。
[0022] 病毒：痘病毒（痘苗病毒 WR 株，Vaccinia Virus WR Strain),记载于"Sjoerd H.E.van den Worm,Klara Kristin Eriksson，Jessika C.Zevenhoven，Friedemann Weber,民oland Zust，Thomas Kuri，民onald Dijkman,Guohui Chang，Stuart G.Siddell， Eric J.Snijder,Volker Thiel,Andrew D. Davidson.民everse Genetics of SARS-民elated Coronavirus Using Vaccinia Virus-Based 民ecombination.PLoS One.2012;7 (3)"-文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。
[0023] 培养液：1 )、细胞生长培养液：WDMEM培养基(Glibo公司产品）为母液，分别加入 10 % (体积分数)胎牛血清(Sigma公司产品），0.2mg/ml谷氨酷胺(Glibo公司产品），lOOU/ml 青霉素，链霉素。2)、细胞维持培养液，胎牛血清含量为2% (体积分数），其余与1)均相同。 3 )、病毒增殖培养液:与细胞生长培养液相同。
[0024] 表没食子儿茶素没食子酸醋化GCG) =Sigma公司产品（分析纯度>95%)，产品编号 为E4143，CAS#989-51-5。
[00巧]单宁酸（Tannin):Sigma公司产品（分析纯度>99%)，产品编号为V900190;CAS# 1401-55-4。
[0026] 黄巧多糖（APS):上海金穗生物科技有限公司产品（2-(畑Ioromethyl )-4-(4-nitro 地 enyl)-l，3-thiazole)(分析纯度>70%)，产品编号为 JS11328;CAS#89250-26-0。
[0027] 阳性对照药物:利己韦林(R化avirin)，美仑生物公司产品。因目前还未有通过改 变宿主细胞膜特性抑制病毒感染的标准阳性对照药物。本研究W目前抗病毒最常用药物利 己韦林作为对照。实验前WPBS缓冲液溶解，制成2560iig/ml过滤，除菌后，-20°C保存。
[002引倒置相差显微镜：日本Olympus公司产品。
[0029] 细胞培养箱:美国Thermo公司产品。
[0030] 多功能酶仪:美国Molecular Devices公司SpectraMax M5型多功能酶标仪。
[0031] 1、细胞复苏与传代
[0032] 液氮中取出Vero细胞，37°C水浴，融化后，W1000巧m离屯、5min，弃上清，加入适当 的细胞生长培养液，反复吹打均匀，使细胞密度约为2 X IO5个/ml ,WlOml/瓶，于T25细胞培 养瓶中，细胞培养箱中常规培养。24h后于镜下观察，细胞的贴壁情况，48-72h后，或待细胞 生长到密度大约为95 %时，弃原培养液，加入PBS缓冲液，漂洗两次，0.5ml 0.25% (0.25g/ 100mL化DTA，于37 °C培养箱中溫育消化，当细胞收缩变圆时，迅速加入细胞生长培养液，终 止消化，反复吹打均匀后，W1000巧m离屯、，5min，弃上清，使悬浮细胞浓度约为IXioMV ml，1 Oml/每瓶，移入T25细胞培养瓶，放置细胞培养箱，进行常规传代培养。
[0033] 2、病毒增殖
[0034] 取细胞生长密度约为80%的T25细胞培养瓶，弃原液，WPBS，漂洗两次，W去除血 清残留，加入已稀释病毒(稀释液为PBS缓冲液），接种量MOI = O.01，W及Iml培养基，晃匀， 置于细胞培养箱中吸附化，弃上清，每瓶加入IOml相应病毒增殖培养液。观察细胞病变，48-7化后，或待细胞病变达75 % W上时，收毒，取上清，反复冻融3次，W 300化pm，4°C，离屯、 5min，分装上清，并测定病毒滴度TCIDso。
[0035] 3、病毒滴度TCID日日测定
[0036] 采用致细胞病变法(CPE)测定，W单细胞悬液，加入96孔微量培养板中，每孔20化 1，使细胞量达到2 X IO5个/ml，细胞培养箱中培养48-7化，直至细胞单层密度约为80 %时， 取出，弃培养基，WPBS漂洗两遍，利用病毒增殖培养液将病毒原液10倍梯度稀释为1(T3~ 10-U，每浓度梯度8孔一列，每孔10化1，设立空白对照两列，于细胞培养箱中吸附化，弃上 清，后加入维持培养液20化1。每日镜下观